重組日本七鰓鰻口腔腺分泌L251蛋白表達(dá)純化及活性鑒定.pdf

1、本項(xiàng)課題根據(jù)日本七鰓鰻口腔腺cDNA文庫中cDNA序列和部分EST預(yù)測(cè)功能基因片段，發(fā)現(xiàn)在日本七鰓鰻口腔腺大量存在中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)樣蛋白質(zhì)，命名為L(zhǎng)251。L251屬于CAP蛋白超家族(CRISPs，Antigen 5 proteins，Pathogenesis-related proteins)、PR-1蛋白亞家族成員，在結(jié)構(gòu)上具有三個(gè)區(qū)域：PR-1結(jié)構(gòu)域、一個(gè)鉸鏈區(qū)，一個(gè)半胱氨酸豐富結(jié)構(gòu)域(CRD)。通過大量相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)

2、與功能的分析與比對(duì)，得出L251蛋白的PR-1亞家族中NIF具有相同的保守序列和功能位點(diǎn)。 根據(jù)序列特異性和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，將L-251功能基因從cDNA文庫中釣取全長(zhǎng)基因，并連接到pET23b表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸肝菌BL21表達(dá)菌中重組表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化得到蛋白質(zhì)包涵體。通過蛋白質(zhì)變性和復(fù)性，用MIGRA test試劑盒對(duì)抑制中性粒細(xì)胞(neutrophil)跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在fMLP誘

3、導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化反應(yīng)中，L251在118nM濃度可抑制75％的中性粒細(xì)胞遷移。此外用熒光染料DHRl23標(biāo)記中性粒細(xì)胞，當(dāng)用L251處理后，發(fā)現(xiàn)由fMLP活化的中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的平均熒光強(qiáng)度最大程度可由55.84下降至16.09。為研究L251抑制中性粒細(xì)胞生理活性的機(jī)理，將中性粒細(xì)胞分別與CD11a、CD11b和CD11c FITC標(biāo)記單克隆抗體孵育來檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面整合素表達(dá)情況，在L251蛋白存在時(shí)，中性粒細(xì)胞表面整合素表達(dá)

4、量有不同程度的減少(P<0.05)，通過流式細(xì)胞儀對(duì)中性粒細(xì)胞前散射和旁散射信號(hào)分析，可觀測(cè)到L251引起粒細(xì)胞的大小及顆粒度均發(fā)生變化。由此可知L251 蛋白在日本七鰓鰻在營(yíng)寄生生活時(shí)于口腔腺分泌液中大量存在的必要性：L251 蛋白通過趨化因子模擬機(jī)制與CD11b/CD18整合素的特異性結(jié)合，干擾趨化性細(xì)胞因子引發(fā)的中性粒細(xì)胞正常生理反應(yīng)。 日本七鰓鰻是繼微生物、病毒、蠕蟲和人類腫瘤之后又一具有免疫逃逸機(jī)制的新物種：其口腔腺分