Gata1調(diào)控的miRNA144-451對貧血影響的初步研究.pdf

1、miR-144和miR-451是一個雙順反子miRNA基因位點。miR-451的表達重約占據(jù)紅細胞發(fā)育晚期miRNA的50％。大量體內(nèi)外實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-144/451在紅細胞發(fā)育成熟過程中和珠蛋白合成過程中起到至關(guān)重要的作用。β地中海貧血患者的前體紅細胞中miR-451的表達明顯增高，miR-144/451參與β地中海貧血的發(fā)生發(fā)展，那么我們猜想miR-144/451是否也在其他類型的貧血中發(fā)揮著重要的作用呢？
　　主要進行

2、以下實驗:
　　1）建立缺鐵性動物模型、慢性失血性貧血動物模型、和注射苯肼致溶血性貧血動物模型;
　　2）檢測miR-144/451在各種貧血模型中的外周血、骨髓以及小鼠胚胎肝紅細胞中表達趨勢;
　　3）研究分析miR-144/451在貧血動物模型中表達增高的分子機制及其臨床意義。通過以上實驗，本研究旨在明確miR-144/451與除β地中海貧血以外的其他類型貧血的關(guān)系，闡明miR-144/451與貧血關(guān)系的可能分子機

3、制。
　　1.三種小鼠貧血模型的建立及其miR-144/451的表達
　　目的:
　　通過物理、化學(xué)等方法建立小鼠貧血模型，觀察缺鐵性貧血小鼠的精神狀態(tài)，皮膚黏膜情況等，用于研究缺鐵性貧血狀態(tài)下miR-144/451表達情況。
　　方法:
　　1）21天大小的C57BL/6小鼠（斷奶小鼠）用缺鐵性飼料(購自南通特洛菲飼料科技有限公司Trophic Animal Feed High-Tech Co.，Ltd，

4、China)飼養(yǎng)，并且在缺鐵性飼料飼養(yǎng)小鼠期間同時喂食超純水以避免水中鐵元素對實驗結(jié)果的影響。然后在飼養(yǎng)缺鐵飼料后的第4-5周目內(nèi)眥采集小鼠外周血檢測，記錄相關(guān)指標變化，檢測小鼠貧血程度。并提取小鼠外周血紅細胞中的總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并運用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-144和miR-451的表達情況。
　　2）C57BL/6小鼠通過腹腔注射濃度為65mg/kg的苯肼溶液，于注射前和注射后的1，2，3，4，5，6，7天

5、目內(nèi)眥采集小鼠外周血檢測，記錄相關(guān)指標變化，檢測小鼠貧血程度。并提取小鼠外周血紅細胞中的總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并運用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-144和miR-451的表達情況。
　　3）每兩天為C57BL/6小鼠目內(nèi)眥放血一次，每次放200μl，連續(xù)放血6次。在最后一次放血后，目內(nèi)眥采集小鼠外周血檢測，記錄相關(guān)指標變化，檢測小鼠貧血程度。并提取小鼠外周血紅細胞中的總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并運用qRT-PCR技

6、術(shù)檢測miR-144和miR-451的表達情況。
　　結(jié)果:
　　小鼠出現(xiàn)貧血癥狀，各組小鼠的皮膚和粘膜顏色蒼白，外周血紅細胞數(shù)量、血紅蛋白含量、紅細胞壓積降低，網(wǎng)織紅細胞比例增高，小鼠表現(xiàn)為貧血狀態(tài)。取小鼠外周血并提取其RNA檢測其miR-144/451的表達，miR-144/451的表達增高。
　　結(jié)論:
　　建立了小鼠貧血模型，可以為用于檢測miR-144/451表達情況的實驗。貧血狀態(tài)下miR-144/4

7、51的表達增高說明miR-144/451可能參與貧血的發(fā)生發(fā)展。
　　2.臨床缺鐵性貧血、腫瘤貧血樣本miR-144/451的表達
　　目的:
　　明確miR-144/451在臨床缺鐵性貧血、腫瘤貧血樣本中的表達，為進一步探討miR-144/451與貧血的關(guān)系及其機制研究提供支持。
　　方法:
　　收集臨床缺鐵性貧血樣本、腫瘤貧血病人血樣本和再生障礙性貧血樣本。并且提取紅細胞中的總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄成cDN

8、A，并運用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-144和miR-451的表達情況。
　　結(jié)果:
　　臨床缺鐵性貧血、腫瘤貧血病人血樣本紅細胞中miR-144/451的表達增高，但是再生障礙性貧血病人血樣本中紅細胞miR-144的表達無明顯變化而miR-451表達減低。
　　結(jié)論:
　　臨床缺鐵性貧血、腫瘤貧血病人血樣本紅細胞中miR-144/451的表達增高說明miR-144/451可能參與病人缺鐵性貧血和腫瘤貧血病人貧

9、血過程的發(fā)生發(fā)展，并且其作用機制不同于再生障礙性貧血疾病。
　　3.miR144/451在貧血過程中的功能研究
　　目的:
　　利用上述建造的小鼠貧血模型和臨床貧血樣本中miR-144/451在紅細胞中的表達情況。通過相同條件同時處理miR-144/451敲除小鼠和野生型小鼠，觀察兩種類型小鼠貧血情況。探究miR-144/451在貧血過程中的功能。
　　方法:
　　利用上述方法同時處理相同年齡，相同性別的m

10、iR-144/451敲除小鼠和野生型小鼠，檢測兩種小鼠外周血常規(guī)變化情況;制作外周血涂片，并進行瑞氏-吉姆薩染色明確小鼠外周血中紅細胞形態(tài)、數(shù)量變化;運用流式細胞技術(shù)檢測小鼠外周血和骨髓中的紅細胞，明確紅細胞的分化成熟度;運用流式細胞儀檢測外周血中網(wǎng)織紅細胞數(shù)量，明確紅細胞成熟度;檢測小鼠脾臟的形態(tài)學(xué)及組織學(xué)變化，明確各組小鼠的代償性造血水平;磁珠分選小鼠骨髓有核紅細胞WB檢測GATA1表達;qRT-PCR檢測小鼠骨髓有核紅細胞中抗氧化

11、應(yīng)激酶包括SOD、Catalase、GPX1、NQO1的表達變化。
　　結(jié)果:
　　1）外周血涂片瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果提示:與貧血處理過的wt組小鼠比較，miR144/451敲除組小鼠外周血紅細胞形態(tài)并改善，紅細胞大小不均勻，細胞破碎，中心淡染區(qū)增大，網(wǎng)織紅細胞計數(shù)明顯增多;
　　2）流式細胞儀檢測結(jié)果提示:與貧血處理過的wt組小鼠比較，miR-144/451敲除組小鼠的外周血中網(wǎng)織紅細胞比例增加，且骨髓及外周血的紅細

12、胞成熟度減低;
　　3）脾臟形態(tài)學(xué)及組織學(xué)結(jié)果提示:與貧血處理過的wt組小鼠比較，miR-144/451敲除組小鼠的脾臟偏大，重量增大，提示小鼠體內(nèi)代償性造血功能減弱;與未處理過的wt組小鼠相比，處理過的貧血wt小鼠GATA1表達增高，抗氧化酶表達量下降。
　　結(jié)論:
　　1）miR-144/451敲除小鼠和經(jīng)處理過的wt貧血小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平增加;
　　2)由于經(jīng)處理過的wt貧血小鼠miR-144/451表