人牙周膜干細(xì)胞成骨分化相關(guān)lncRNAs的篩選及鑒定.pdf

1、本論文主要包括以下四章內(nèi)容:
　　第一章 人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定
　　本章實驗采用改良酶組織塊法及有限稀釋法分離純化hPDLSCs，CCK8法檢測并繪制細(xì)胞生長曲線，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)記物，采用單克隆形成實驗和多向誘導(dǎo)實驗分別檢測細(xì)胞的克隆形成能力及多向分化潛能。
　　第二章 基因芯片檢測人牙周膜干細(xì)胞成骨分化相關(guān)lncRNA及其驗證
　　采用基因芯片技術(shù)對成骨誘導(dǎo)14 d及對照組hPDLS

2、Cs的RNA提取物進行檢測，分析成骨誘導(dǎo)前后hPDLSCs中mRNA及l(fā)ncRNA的表達水平變化情況，利用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)技術(shù)對基因芯片的檢測結(jié)果進行驗證。
　　第三章 人牙周膜干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)前后lncRNA-mRNA共表達譜的構(gòu)建及關(guān)鍵lncRNA的篩選
　　利用基因本體論(gene ontolo

3、gy，GO)、路徑分析(pathway analysis)等生物信息學(xué)方法對基因芯片結(jié)果進行初步的分析，采用編碼-非編碼-基因共表達（coding-noncoding gene co-expression，CNC）網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)構(gòu)建lncRNA與mRNA之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖譜，根據(jù)分析結(jié)果篩選出在hPDLSCs成骨分化過程中的關(guān)鍵lncRNA; qRT-PCR檢測關(guān)鍵lncRNA在hPDLSCs成骨誘導(dǎo)前后及牙周膜組織中的表達水平。
　

4、　第四章 抑制TCONS_00007046表達對人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響
　　構(gòu)建lncRNA TCONS_00007046 shRNA慢病毒并進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，利用qRT-PCR檢測慢病毒抑制效率，CCK8法檢測抑制TCONS_00007046表達對hPDLSCs增殖能力的影響。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性染色及茜素紅S染色檢測成骨誘導(dǎo)14 d后檢測抑制TCONS_00007046表達對hP

5、DLSCs成骨分化的影響，并利用qRT-PCR法檢測成骨相關(guān)基因（ALP、OCN、Runx2、BMP2及BMP6）表達水平變化。
　　材料方法：
　　組織獲取及細(xì)胞培養(yǎng)
　　實驗中所用離體牙取自南方醫(yī)院口腔頜面外科門診18～25歲患者因阻生需要拔除的健康、完整的第三磨牙（經(jīng)患者知情同意）。所選患者無其他系統(tǒng)性疾病史、吸煙或特殊用藥史。牙齒拔除后迅速置于含雙抗的α-MEM培養(yǎng)液中，放入冰盒內(nèi)送入實驗室。在超凈臺內(nèi)輕輕刮取

6、牙根中1/3的牙周膜組織，PBS緩沖液中反復(fù)漂洗。用眼科剪將組織小心地剪碎成1 mm×1mm×1mm大小，置于3 mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4mg/mL的中性蛋白酶混合液中，37℃水浴消化30min。加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，800 rpm離心3 min，小心棄去上清，并加入少量完全培養(yǎng)基，用槍頭輕輕吹打均勻，使細(xì)胞懸液與松散組織呈混勻狀態(tài)，接種至6孔板內(nèi)鋪平，加蓋玻片于組織塊之上并加入適量含有10％胎牛血清、100μmol/L磷酸鹽抗

7、壞血酸、2mmol/L谷氨酸鹽、100 U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液，于5％CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)，每2～3 d換液。
　　取第1代人牙周膜細(xì)胞，胰酶消化制成細(xì)胞懸液，并利用逐步稀釋法將細(xì)胞濃度調(diào)整為10～15個/mL。按100μL/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板中，5％CO2、37℃環(huán)境培養(yǎng)12 h后，在倒置顯微鏡下進行觀察，標(biāo)記出僅含單個細(xì)胞的孔并加培養(yǎng)液至20μL，每2～3 d換液，當(dāng)單細(xì)胞生長匯

8、合至70～80％時消化傳代。CCK8實驗
　　取第3代生長狀態(tài)良好的hPDLSCs，以2×103個/孔的密度（約100μL/孔細(xì)胞懸液）接種于96孔板中，5％ CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，向每孔內(nèi)加入10μL CCK8溶液，“十”字法混勻后避光培養(yǎng)1～4h，然后用多功能酶標(biāo)儀檢測490 nm波長下各孔的OD值，并取平均值繪制生長曲線。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)記物
　　取第3代處于對數(shù)生長期的hPD

9、LSCs，以1×106個/mL的密度重懸于預(yù)冷的PBS緩沖液中。以小鼠抗人PE示記的CD146、CD29、CD31、CD34、CD90抗體及APC標(biāo)記Stro-1抗體，冰上遮光孵育1h。預(yù)冷的PBS緩沖液清洗2～3次后，上流式細(xì)胞儀檢測表面分子標(biāo)記物。
　　克隆形成率檢測
　　取第3代細(xì)胞，以1×102個皿的密度接種于100 mm直徑的培養(yǎng)皿中。置于5％ CO2、37℃環(huán)境培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14d后，棄去原培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗

10、后，用4％的多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色劑染色，倒置顯微鏡下觀察單克隆形成情況（以≥50個細(xì)胞為一個克?。⒂嬎慵?xì)胞克隆形成率。
　　多向分化能力檢測
　　取第3代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至80％匯合時，棄去原培養(yǎng)液，并分別加入成骨、成脂誘導(dǎo)液，每3d換液。連續(xù)培養(yǎng)21d后，分別用2％茜素紅S、油紅O染色劑染色，顯微鏡下觀察。
　　RNA提取與基因芯片檢測
　　對第

11、3代hPDLSCs進行成骨誘導(dǎo)，對照組常規(guī)培養(yǎng)，分別提取培養(yǎng)14 d后兩組細(xì)胞的總RNA，Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。NanoDropND-1000紫外分光光度計檢測其濃度與純度，分別進行l(wèi)ncRNA和mRNA表達譜基因microarray芯片檢測，每組檢測重復(fù)分別3次。
　　實時熒光定量PCR檢測
　　提取細(xì)胞總RNA，檢測其純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，SYBR Green法進行PCR擴增，以GADPH作為內(nèi)參基

12、因，以2-ΔΔCt值代表基因的相對表達強度。
　　生物信息學(xué)分析
　　利用基因芯片結(jié)果，綜合數(shù)據(jù)庫資源，利用聚類分析、GO分析、pathway分析等生物信息學(xué)方法，對基因芯片的檢測結(jié)果進行初步的分析，以P值大小作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05時認(rèn)為數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.人牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)特性觀察
　　本實驗采用改良酶組織塊法及有限稀釋法分離獲得hPDLSCs，成骨及成脂誘導(dǎo)實驗證明

13、其有多向分化能力，克隆形成實驗檢測其具有克隆形成能力。流式檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞陽性表達間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子標(biāo)記物CD29(99.62％)，CD90(97.13％)， CD146(10.27％)和Stro-1(12.76％);陰性表達造血干細(xì)胞分子標(biāo)記物CD31(0.07％)和CD34(0.22％)。
　　2.成骨誘導(dǎo)前后lncRNA及mRNA差異表達情況
　　基因芯片檢測結(jié)果顯示，hPDLSCs成骨誘導(dǎo)后共有994個lncRN

14、A出現(xiàn)上調(diào)表達，1177個下調(diào)表達;共有3557個mRNA在成骨誘導(dǎo)后出現(xiàn)差異表達，其中1578個上調(diào)，1979個下調(diào)（變化倍數(shù)＞2.0或＜-2.0，P＜0.05）。挑選lncRNA及mRNA進行qRT-PCR驗證，其結(jié)果與芯片檢測結(jié)果基本吻合。
　　3.lncRNA-mRNA共表達譜構(gòu)建及關(guān)鍵lncRNA的挑選
　　GO分析結(jié)果示，出現(xiàn)差異表達的mRNA與細(xì)胞生理過程、生物調(diào)節(jié)等多個過程存在顯著相關(guān)性;Pathway分析示

15、共有83條信號通路參與了hPDLSCs成骨分化過程，包括MAPK、VEGF及TGF-β等通路。挑選成骨相關(guān)mRNA(ALP、BMP6、COL1A1、COL1A2、IL6、BMP5及BMP2)作為靶基因進行CNC分析并構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達圖譜，顯示共有131對lncRNA及mRNA之間存在負(fù)相關(guān)，有262對正相關(guān)。對檢測結(jié)果進行分析，挑選出TCONS_00007046作為進一步研究對象，qRT-PCR對其表達進行驗證顯示該基因

16、在PDL組織及hPDLSCs細(xì)胞內(nèi)均存在表達，且成骨誘導(dǎo)后變化趨勢與基因芯片結(jié)果具有一致性。
　　4.抑制TCONS_00007046表達對人牙周膜干細(xì)胞成骨分化、增殖的影響
　　本實驗成功構(gòu)建TCONS_00007046 shRNA慢病毒載體，并利用qRT-PCR檢測其抑制效率。CCK8法檢測結(jié)果顯示抑制TCONS_00007046表達對hPDLSCs增殖不產(chǎn)生影響。ALP活性染色檢測結(jié)果顯示，對細(xì)胞進行14 d的成骨誘導(dǎo)

17、后，TCONS_00007046表達抑制的hPDLSCs細(xì)胞中的ALP活性較低。茜素紅S染色結(jié)果亦顯示，TCONS_00007046表達抑制組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成量較對照組細(xì)胞少。qRT-PCR法檢測結(jié)果顯示，抑制TCONS_00007046表達時，成骨相關(guān)mRNAALP、OCN、Runx2、BMP2及BMP6的表達水平降低。
　　結(jié)論：
　　(1)本實驗利用有限稀釋法分離培養(yǎng)出人牙周膜干細(xì)胞，具有在體外克隆形成及成骨、成脂向分

18、化的能力。(2)在人牙周膜干細(xì)胞及其成骨分化過程中均存在大量lncRNA的顯著差異表達。(3)生物信息學(xué)初步分析結(jié)果顯示，lncRNA在人牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中發(fā)揮著調(diào)控作用，其可能與成骨相關(guān)基因的表達有關(guān)，且該調(diào)控過程可能有多條信號通路的參與。(4)lncRNATCONS_00007046對hPDLSCs的增殖不產(chǎn)生影響，抑制TCONS_00007046表達時，hPDLSCs的成骨能力受到抑制，且該調(diào)控過程可能與成骨相關(guān)mRNA