中國人群CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4基因多態(tài)性與茶堿體內(nèi)清除率的相關(guān)性研究.pdf

1、茶堿是臨床常用的平喘藥，應(yīng)用已有80多年的歷史，平喘作用快，能迅速改善呼吸道痙攣狀況。而且茶堿類藥物有很多常見的不良反應(yīng)，如心率失常、心肌缺血、失眠、譫妄、癲癇等，嚴重可導(dǎo)致死亡。因而茶堿的臨床應(yīng)用必須在血藥濃度監(jiān)測下合理應(yīng)用，才能保證給藥的安全性和有效性，國內(nèi)外都將其列為主要監(jiān)測藥物之一。
　　由于肝細胞色素P450酶1A2(CYP1A2)對茶堿具有高親和力，低濃度茶堿在體內(nèi)的代謝過程主要由CYP1A2介導(dǎo)。細胞色素P450酶2

2、E1(CYP2E1)對茶堿具有低親和力和高容量，因此在高濃度時主要由CYP2E1介導(dǎo)。細胞色素P450酶3A4(CYP3A4)也參與了茶堿體內(nèi)的代謝，但是，由于CYP3A4對茶堿具有低親和力和低容量，因此對茶堿代謝的影響較小。三個代謝酶的基因多態(tài)性是否對茶堿體內(nèi)代謝有影響仍然沒有定論。
　　我們的前期工作分析了426名健康中國人CYP1A2酶活性與其功能位點的關(guān)系，發(fā)掘了5個單倍型標(biāo)簽SNP，構(gòu)建了15條純合子及突變頻率大于3％的

3、雜合子的單倍體。考察了這5個位點SNP及15條單倍體對CYP1A2酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)CYP1A2新的突變位點G-3113A影響CYP1A2酶活性，G→A的突變酶活性降低，CYP1A2*1B與CYP1A2*1C野生純合子CYP1 A2酶活性略降低，而T3594G和CYP1A2*1F不同基因型間CYP1 A2的活性無顯著差異。單倍型之間CYP1A2酶活性也存在較大的差異，攜帶-3113A/A位點單倍型對表現(xiàn)為低酶活性，攜帶-3113G/G位

4、點單倍型對表現(xiàn)為高酶活性。在這個研究基礎(chǔ)上，我們進一步研究了37個健康中國人4個功能性位點突變純合子對茶堿體內(nèi)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)4個位點突變純合子之間茶堿體內(nèi)代謝無差異。
　　因此，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)CYP1A2 G-3113A位點突變可能導(dǎo)致CYP1A2酶活性降低，由于受樣本量的影響，未發(fā)現(xiàn)CYP1A2 G-3113A對茶堿體內(nèi)代謝影響具有統(tǒng)計學(xué)意義，因此茶堿體內(nèi)代謝的個體差異的機制仍然不是很清楚。本研究試圖從CYP1A2、CYP

5、2E1、CYP3A4三個代謝酶功能位點的突變，分析對茶堿體內(nèi)清除率的影響，以明確影響茶堿體內(nèi)代謝個體差異的遺傳機制。
　　方法:
　　篩選了2013年9月-2014年7月符合入組條件的門診患者111例，脫落10例，最終入組101例，其中男性受試者63例，女性38例，其中吸煙者18例，不吸煙者83例。101例受試者采集空白血樣后，口服茶堿100 mg，2/日。2周后復(fù)診，空腹不服藥后采集外周血樣2 ml于EDTA抗凝管，-80

6、℃低溫冰箱凍存。試驗前征得南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理委員會同意，簽署知情同意書。試驗在美國臨床試驗網(wǎng)(ClinicalTrials.gov)注冊，并獲得了注冊編號(NCT02001935)。茶堿及其代謝產(chǎn)物（1，3-二甲基尿酸）的測定采用高效液相色譜法(HPLC)的方法。茶堿清除率用1，3-二甲基尿酸/茶堿(1，3-DU/TP)比值來計算。應(yīng)用酚-氯仿法提取外周血白細胞中的DNA，進行PCR產(chǎn)物擴增后基因測序儀直接測序。CYP1A2基因檢

7、測了5個位點，CYP1A2 G-3860A（CYP1A2*1C）、C-164A(CYP1A2*1F)、C5347T(CYP1A2*1B)、G-3113A是我們前期研究發(fā)現(xiàn)在中國人群中存在多態(tài)性的位點，G-3533A(CYP1A2*7)在白種人中報道有功能活性的位點，此次也納入檢測范圍。CYP2E1檢測了4個在亞裔人群中報道有功能活性的4個位點:G1132A（CYP2E1*2）、G10023A(CYP2E1*3)、G4768A(CYP2E

8、1*4)、G-1293C/C-1053T(CYP2E1*5B)。CYP3A4檢測了5個在亞裔人群中報道具有多態(tài)性的位點:A13871G（CYP3A4*4）、C15702G（CYP3A4*5）、17661del(CYP3A4*6)、T20070C(CYP3A4*18A)、C23237T(CYP3A4*19)。對檢測出有多態(tài)性的位點進行了單倍體的構(gòu)建，進一步統(tǒng)計分析單個核苷酸位點多態(tài)性(SNP)及單倍型對茶堿體內(nèi)清除率的影響。
　　統(tǒng)

9、計方法:
　　所有數(shù)據(jù)用mean±SD表示，按照不同基因型對受試者分組。單個SNP位點不同基因型間茶堿清除率的比較采用單因素方差分析的方法(One-way Analysisof Variation，one-way ANOVA)。不同性別間及兩種基因型之間茶堿清除率的比較采用獨立樣本雙側(cè)t檢驗方法。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著意義。所有統(tǒng)計采用SPSS13.0軟件。
　　結(jié)果:
　　1.101患者中有1例樣本檢測

10、數(shù)據(jù)缺失，計算了100例樣本茶堿的藥物濃度及茶堿清除率。100例患者口服茶堿100 mg，2/日后平均穩(wěn)態(tài)濃度為3.52±1.45mg/L（mean±SD），最高濃度:8.31 mg/L，最低:1.13 mg/L。平均茶堿清除率(1，3-DU/TP)0.058±0.033，最高清除率:0.259，最低清除率:0.041。茶堿體內(nèi)清除率存在著較大的個體差異。
　　2.101例受試者CYP1A2 G-3860A(CYP1A2*1C)突

11、變頻率為30.7％、C-164A(CYP1A2*1F)突變頻率為30.0％、C5347T（CYP1A2*1B）突變頻率為15.8％、G-3113A突變頻率為9.9％。這幾個位點的突變頻率與我們之前研究的結(jié)果非常一致，而與白種人群的突變頻率相差較大。而G-3533A(CYP1A2*7)在白種人中報道存在多態(tài)性，我們這次研究沒有發(fā)現(xiàn)該位點存在突變。進一步分析4個具有多態(tài)性的位點不同基因型茶堿清除率之間的差異發(fā)現(xiàn)，CYP1A2 G-3860A

12、、C-164A、C5347T不同基因型之間茶堿清除率沒有差異(P＞0.05)。G-3113A突變純合子AA型只有2例，合并到突變雜合子GA組，與野生型GG組比較，茶堿清除率有差異(P=0.016)，-3113位點G→A茶堿清除率降低。
　　3.CYP2E1 G1132A（CYP2E1*2）突變頻率為0.5％，與文獻報道的亞裔人群突變頻率1.2％稍有差異。G10023A(CYP2E1*3)、G4768A(CYP2E1*4)本次研究未

13、篩查到具有突變。G-1293C/C1053T(CYP2E1*5B)突變頻率為18.8％，與文獻報道的亞裔人群中的突變頻率19-27％接近，但是與白種人中報道的突變頻率0.8-1.0％，相差較大。進一步分析CYP2E1*5B不同基因型之間茶堿清除率之間的差異發(fā)現(xiàn)，CYP2E1*5B不同基因型之間茶堿清除率沒有差異（P=0.731）。
　　4.CYP3A4檢測了5個位點突變頻率較低。篩查到A13871G（CYP3A4*4）突變雜合子僅

14、1例，突變頻率0.5％，T20070C（CYP3A4*18A）突變雜合子4例，突變頻率為2％。其他3個位點C15702G（CYP3A4*5）、17661 del(CYP3A4*6)、C23237T(CYP3A4*19)沒有篩查到突變。進一步分析T20070C（CYP3A4*18A）野生型純合子與雜合子之間茶堿清除率的差異，沒有發(fā)現(xiàn)CYP3A4*18A位點突變對茶堿清除率有影響。
　　5.對具有多態(tài)性的CYP1A2的4個位點的SNP

15、進行單倍型構(gòu)建，共構(gòu)建了15條單倍型基因型。對單倍型對進行進一步的茶堿清除率分析發(fā)現(xiàn)，單倍型對-3113G/G-164A/A-3860G/G-5347T/C與其他單倍型比較茶堿清除率增加，而其他單倍型茶堿清除率無差異。
　　結(jié)論:
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)，茶堿100 mg，2/日的給藥劑量，2周后體內(nèi)平均穩(wěn)態(tài)藥物濃度為3.52 mg/L，達不到茶堿常用的平喘濃度(10-20mg/L)，＜10 mg/L的茶堿濃度能起到一個免疫調(diào)節(jié)

16、和增強激素敏感性的作用，建議小劑量茶堿與激素合用，以達到茶堿增強激素敏感性的作用。
　　2.本次研究考察了CYP1A2、CYP2E1與CYP3A4的14個位點，CYP1A2的4個位點與CYP2E1的1個位點突變頻率較高，即CYP1A2 G-3860A(CYP1A2*1C)、C-164A(CYP1A2*1F)、C5347T(CYP1A2*1B)、CYP1A2G-3113A、G-1293 C/C1053T(CYP2E1*5B)突變頻率

17、較高，與文獻報道的亞裔人群的突變頻率接近，但是與白種人群的突變頻率相差較大。而其他的幾個位點突變頻率較低或者是沒有突變，與文獻報道的突變頻率稍有差異。因此本次研究也證實了CYP1A2、CYP2E1與CYP3A基因多態(tài)性存在著種族差異。
　　3.分析突變頻率較高的幾個SNP不同基因型茶堿清除率的差異后僅發(fā)現(xiàn)CYP1A2 G-3113A位點茶堿體內(nèi)清除率降低，未發(fā)現(xiàn)其他位點突變對茶堿體內(nèi)清除率有影響。這是本次研究首次發(fā)現(xiàn)CYP1A2