MBD2基因缺陷促進血管生成并改善小鼠下肢缺血損傷.pdf

1、本文對MBD2基因缺陷促進血管生成并改善小鼠下肢缺血損傷問題進行了研究。主要內容如下：
　　 ㈠概述。內皮細胞是組織血管的組成成分，擔任了調節(jié)營養(yǎng)物質運輸以及激活血液中細胞和分子物質的多項生物學潛能。內皮細胞能起著控制血管功能的作用，是血管疾病最初也是最關鍵的防御。由于血管疾病病因同時涉及了遺傳因素和表觀遺傳學因素，找到一個最小副作用的最優(yōu)的治療靶點是一個巨大的挑戰(zhàn)。作為表觀遺傳學的重要組成成分，DNA甲基化的改變在有血管疾病的

2、病人和動物體內很常見。近來研究表明DNA甲基化可以作為反映環(huán)境對不同種類的細胞影響的“印記”。這種DNA甲基化印記可以被一個甲基化-CpG結合域（MBD）的保守家族所“閱讀”。這個保守家族包括MBD1，MBD2，MBD3，MBD4和MeCP2五個成員。它們與其他一些蛋白一起影響著DNA甲基化引起的轉錄抑制和（或）異染色質的形成。因此，他們影響著表觀遺傳基因組的生成，維持和相互作用。每個MBD家族成員可以以它與甲基化DNA結合的親和力來區(qū)

3、分，其中親和力最強的是MBD2，而MBD3則不能結合甲基化的DNA。除了MBD3外，MeCP2，MBD1，MBD2和MBD4缺陷的小鼠都可以存活。其中MBD2缺陷的小鼠除了雌性小鼠會有哺乳行為的缺陷外，顯示幾乎完全正常的表型，表明MBD2有極大可能性作為表觀遺傳學治療的優(yōu)良靶點。我們想檢測MBD2在內皮細胞中的作用。我們設想，作為一個關鍵的表觀遺傳學調節(jié)因子，MBD2能夠改變內皮細胞特異性基因的表達，并且在內皮細胞功能紊亂和血管生成方面

4、起調節(jié)作用。我們發(fā)現抑制MBD2的表達可以顯著地增強血管生成，抑制雙氧水引起的內皮細胞凋亡。MBD2基因缺陷小鼠顯著改善下肢缺血之后的血流恢復?？紤]到生理狀態(tài)下MBD2基因缺陷小鼠幾乎正常的表型，我們的結果表明MBD2有潛力作為治療和預防內皮細胞損傷的靶點。
　　 ㈡MBD2表達降低能保護雙氧水誘導的內皮細胞凋亡并促進血管生成。首先用MBD2干擾RNA或對照干擾RNA轉染人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），檢測降低MBD2表達對內皮

5、細胞功能的影響。Western blot檢測到人臍靜脈內皮細胞表達MBD2，并且檢測到MBD2干擾RNA轉染后能劑量依賴性地抑制MBD2的表達。當用100 nmol/l的MBD2干擾RNA轉染臍靜脈內皮細胞后，MBD2的表達幾乎被完全抑制。然后我們將干擾RNA轉染后的臍靜脈內皮細胞種到減生長因子martigel預處理過的培養(yǎng)板。MBD2表達降低后明顯增強了內皮細胞在減生長因子matrigel里成管的形成。我們于培養(yǎng)4小時后即可觀察到MB

6、D2干擾RNA轉染后的內皮細胞有管狀的形成，而對照干擾RNA轉染后的細胞此時還沒有明顯的管狀形成。轉染24小時后，MBD2干擾RNA轉染后的細胞成管數量在單位面積里明顯超過對照RNA轉染的內皮細胞成管數量。為檢測MBD2對內皮細胞增殖的影響，轉染后的細胞用氚三標記包嘧啶法進行了增殖實驗。我們于16小時后發(fā)現MBD2干擾RNA轉染后的細胞增殖明顯比對照RNA轉染后的細胞快。接著我們又檢測了MBD2干擾RNA轉染對細胞凋亡的影響，在RNA干

7、擾后24小時后，我們用0.2mM的雙氧水又孵育了24小時。我們發(fā)現MBD2干擾RNA轉染后降低了雙氧水引起的內皮細胞凋亡。這些都表明了MBD2負調節(jié)血管生成并能促進雙氧水誘導的內皮細胞凋亡。
　　 ㈢MBD2基因缺陷小鼠較正常小鼠顯著促進后肢缺血后的恢復。臨床上心血管疾病病人預后不佳與其對缺血反應的血管生成能力低下有關。鑒于我們觀察到MBD2基因負調節(jié)內皮細胞血管生成，我們檢測了它在缺血損傷后對血流灌注的影響。我們首先驗證了MB

8、D2敲除小鼠的血管中MBD2蛋白表達降低。接著，我們給野生型小鼠做了股動脈結扎摘除術使之下肢缺血，并在不同的缺血時間后檢測MBD2蛋白的表達是否有改變。在生理狀態(tài)下，只能檢測到較低水平的MBD2.但是在缺血發(fā)生后，MBD2蛋白水平增加了，并且在缺血后第四天左右達到最高，之后MBD2水平又慢慢回落且在術后14天左右回到相對低的水平。免疫染色顯示MBD2表達主要在血管上并且主要在內皮細胞上（與CD31表達大部分重合）。下肢缺血后的免疫染色顯

9、示MBD2表達增高同時伴隨著CD31表達也增高，說明內皮細胞在缺血后的成管能力可能與MBD2表達水平相關。為了確定MBD2基因在缺血后血流恢復中的作用，我們對MBD2敲除小鼠和對照小鼠進行了單側后肢缺血手術。手術后所有小鼠都存活了。術前和術后我們用激光多普勒探測缺血側和非缺血側下肢的血流灌注情況。MBD2敲除小鼠在術后第2天就有小部分的血流回復，術后第七天就恢復到了50％，術后第14天幾乎完全恢復。但是野生型小鼠直到第4天才有小部分的血

10、流恢復，術后第7天才恢復了30％左右，術后第14天才恢復了60％左右。為檢測新生血管的差別，我們檢測了毛細血管（CD31陽性細胞）和小動脈（平滑肌α-actin陽性細胞）形成。我們發(fā)現MBD2敲除小鼠的切片中CD31陽性細胞和平滑肌α-actin陽性細胞較對照組增多。總的來說，我們的結果顯示MBD2表達降低可以促進缺血后毛細血管生成和小動脈血管生成進一步促進缺血后血流灌注的恢復。
　　 ㈣抑制MBD2表達可以激活內皮細胞生存和促

11、血管生成信號通路。檢測了兩個最主要的內皮細胞生存信號通路：ERK和AKT。我們用MBD2特異性siRNA或者對照的siRNA轉染人臍靜脈內皮細胞降低MBD2表達水平，然后檢測兩組細胞磷酸化的ERK和AKT水平。我們發(fā)現轉染后兩組細胞磷酸化AKT水平并無明顯改變，但是轉染后MBD2組磷酸化ERK表達水平較對照組顯著增高。鑒于磷酸化ERK能穩(wěn)定BCL-2，而BCL-2是一個抗凋亡的蛋白，我們又檢測了雙氧水處理之后兩組BCL-2表達水平，結果

12、發(fā)現MBD siRNA轉染組BCL-2表達水平增高。進一步，我們檢測了MBD2敲除小鼠和正常小鼠中磷酸化ERK和BCL-2等表達，得到相似的結論。令人驚奇的是，MBD2表達降低后并不影響抗氧化應激的兩個主要酶：MnSOD和Cu/Zn SOD的表達。為找尋MBD2負調節(jié)血管生成的機制，我們檢測了兩大關鍵因子eNOS和VEGF-R2的表達。我們發(fā)現MBD2 siRNA轉染人臍靜脈內皮細胞后增加了內皮細胞磷酸化eNOS，總eNOS以及VEGF

13、-R2表達水平。MBD2敲除小鼠以及對照小鼠的血管也顯示了類似的結果。我們還進一步檢測了p38 MAPK的表達，發(fā)現MBD2 siRNA組和MBD2敲除小鼠血管中磷酸化p38顯著增高?？偟膩碚f，抑制MBD2表達很可能是通過激活細胞生存和促血管生成信號通路來增強內皮細胞生存和促血管生成。
　　 ㈤eNOS協(xié)同VEGF-R2促進內皮細胞生存和血管生成。為了闡述上述信號分子之間的聯(lián)系，我們使用VEGF-R2或eNOS的抑制劑來處理內皮

14、細胞觀察生存和血管生成信號通路的反應。VEGF刺激不影響總VEGF-R2、總eNOS和總ERK1/2的表達，但能促進VEGF-R2、eNOS和ERK1/2的活化并增強Bcl-2的表達。和預想的一樣，VEGF-R2中和抗體或者化學抑制劑（SU1498）抑制了VEGF引起的VEGF-R2、ERK1/2和BCL-2活化。eNOS的活化也被中度抑制。而用eNOS抑制劑L-NAME處理內皮細胞再用VEGF處理后，不僅 磷酸化eNOS活化降低，同時

15、VEGF-R2、ERK1/2和BCL-2活化也顯著降低。這些結果表明ERK1/2和BCL-2是eNOS和VEGF-R2的下游，并且eNOS協(xié)同VEGF-R2一起增強內皮細胞生存和血管生成通路。為進一步證實上述結論，接下來我們在下肢缺血手術后MBD2敲除小鼠和對照小鼠的飲水中放入或不放入L-NAME并觀察四組小鼠術后血流恢復情況。給予L-NAME后MBD2敲除小鼠和正常小鼠血流恢復無明顯差別，說明L-NAME能消除MBD2基因缺陷引起的血

16、流恢復變化。
　　 ㈥MBD2可以結合到eNOS和VEGF-R2啟動子區(qū)的高GC含量區(qū)域。上述結果中MBD2表達降低增高了eNOS和 VEGF-R2的表達，而且以往的研究也表明甲基化對eNOS和VEGF-R2的表達有作用，促使我們去探索MBD2是不是直接結合到eNOS和VEGF-R2啟動子區(qū)從而抑制了它們的表達。雖然在eNOS啟動子區(qū)沒有明顯的CpG島，但我們發(fā)現在5’非編碼區(qū)有一個GC富含區(qū)域。相對而言，我們在VEGF-R2啟

17、動子區(qū)發(fā)現了兩個典型的CpG島。接著，我們用染色體免疫共沉淀法獲得了MBD2-DNA復合物。然后我們針對eNOS啟動子區(qū)/5’非編碼區(qū)設計了覆蓋全長的多對引物，針對VEGF-R2的兩個CpG島設計了三對引物，并用這些引物去擴增MBD2結合的DNA片段。覆蓋eNOS啟動子區(qū)的8對引物都沒有得到擴增產物，而覆蓋eNOS的5’端非編碼區(qū)的兩對引物得到了陽性擴增產物。另人驚訝的是，針對VEGF-R2的CpG島設計的三對引物中，只有覆蓋-64到+

18、167區(qū)域的第三對引物得到了擴增產物。為進一步證實我們的推論，我們首先用對照siRNA或MBD2 siRNA轉染HUVEC 24小時，然后再用5-azadc（DNA甲基化酶抑制劑）處理細胞24小時，檢測eNOS和VEGF-R2的表達。我們發(fā)現5-azadc處理后，MBD2表達降低帶來的eNOS和VEGF-R2增高效應被抑制了，說明這其中有甲基化的參與。接著，我們用染色體免疫共沉淀法獲得了MBD2-DNA復合物。然后我們針對eNOS啟動子

19、區(qū)/5’非翻譯區(qū)設計了覆蓋全長的多對引物，針對VEGF-R2的兩個CpG島設計了三對引物，并用這些引物去擴增MBD2結合的DNA片段。覆蓋eNOS啟動子區(qū)的8對引物都沒有得到擴增產物，而覆蓋eNOS的5’端非翻譯區(qū)的兩對引物得到了陽性擴增產物。令人驚訝的是，針對VEGF-R2的CpG島設計的三對引物中，只有覆蓋-64到+167區(qū)域的第三對引物得到了擴增產物。為進一步證實上述CHIP結果，我們特別用bisulfite DNA測序方法檢測了

20、eNOS 5’端區(qū)域的13個CpG位點的甲基化情況。我們發(fā)現在生理情況下，eNOS 5’端區(qū)域的13個CpG位點存在甲基化，并且在模擬缺血（缺氧加血清饑餓）刺激下，內皮細胞DNA總體甲基化程度增高。我們接著又做了EMSA實驗來證明MBD2能夠結合到eNOS的這個區(qū)域的甲基化CpG上。生物素標記的PCR產物（+31 to+197）首先取一部分被SssI甲基化酶處理，然后我們用經甲基化酶處理或者未經甲基化酶處理的PCR產物作為探針去檢測MB

21、D2的結合活性。我們發(fā)現MBD2可以結合到那些甲基化過后的PCR產物，并且親和力很高。為進一步論證MBD2結合到那些甲基化后的CpG元件后，抑制了eNOS的轉錄活性，我們將eNOS啟動子區(qū)（-1700到+350）克隆進pGL-2載體（pGL-eNOS）.我們還構建了一個突變的eNOS啟動子報告載體（pGL-eNOSm），在構建的時候，-200到+300這一段區(qū)域CpG中的C都突變?yōu)锳。接著我們將pcDNA-MBD2載體、pGL-TK載體

22、和pGL-eNOS 載體或者pcDNA-MBD2載體、pGL-TK載體和pGL-eNOSm 載體分別共轉HUVEC細胞做熒光報告基因檢測。我們的結果顯示只有甲基化后的載體報告子顯示有熒光活性的差異，表現在CpG元件缺失后報告熒光的活性增加近一倍。相對而言，在沒有被甲基化的情況下，pGL-eNOS載體和pGL-eNOSm載體的報告熒光活性沒有顯著差異。這些結果都表明了MBD2直接結合到eNOS和VEGF-R2的啟動子區(qū)域的CpG元件上，并

23、抑制了它們的轉錄水平。
　　 ㈦MBD2對eNOS轉錄過程的抑制只限于內皮細胞，并且這個過程中涉及了染色體重構。有報導表明MBD2介導的轉錄抑制與HDACs引起的染色體重構有關。為了檢測MBD2對eNOS轉錄的抑制是否也涉及了染色體重構，我們在MBD2特異性siRNA和對照siRNA轉染后的內皮細胞的培養(yǎng)基中加入TSA。TSA是組氨酸去乙酰化酶（HDAC）的抑制劑，但是在內皮細胞中加入TSA會引起eNOS表達的降低。另人驚訝的是

24、，加入TSA后MBD2特異性siRNA轉染組和對照siRNA轉染組 eNOS的表達變得沒有明顯差別了，說明TSA處理消除了MBD2特異性siRNA增強eNOS表達的作用。TSA處理在非內皮細胞中能誘發(fā)eNOS表達，而降低MBD2表達在內皮細胞能引起eNOS表達增加，促使我們去研究MBD2表達降低對非內皮細胞eNOS表達的作用。我們將MBD2特異性siRNA和對照siRNA轉染Hela細胞，并在轉染后的Hela細胞中加入TSA或DMSO（

25、對照溶劑）后檢測eNOS的表達。令人驚訝的是，在Hela細胞中TSA能誘發(fā)eNOS表達，而在Hela細胞中降低MBD2蛋白表達并沒有誘發(fā)eNOS表達。我們用HEK293細胞也得到了相似的結論。接著我們將MBD2敲除小鼠和對照小鼠的脾細胞分離出來，并用TSA或者DMSO（對照溶劑）處理，檢測eNOS表達，發(fā)現TSA處理可以誘發(fā)脾細胞表達eNOS，而DMSO處理的MBD2敲除小鼠和對照小鼠的脾細胞都不表達eNOS。從以上結果，我們得出了這樣

26、一個結論，MBD2對eNOS轉錄抑制僅限于內皮細胞，且此過程涉及了HDACs和染色體重構。
　　 ㈧結論：⑴研究證明MBD2在下肢缺血后的血流恢復中起重要作用；⑵MBD2表達降低能保護雙氧水誘導的內皮細胞凋亡并促進血管生成；⑶抑制MBD2表達可以激活內皮細胞生存和促血管生成信號通路；⑷MBD2可以結合到eNOS和VEGF-R2啟動子區(qū)的高GC含量區(qū)域；⑸MBD2對eNOS轉錄過程的抑制只限于內皮細胞，并且這個過程中涉及了染色體重