鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)因子1通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N端糖基化上調(diào)β淀粉樣蛋白的生成.pdf

1、唐氏綜合癥(Downsyndrome，DS)是最常見(jiàn)的人類(lèi)遺傳性疾病之一，以先天性認(rèn)知功能缺陷，癡呆，學(xué)習(xí)記憶能力低下以及先天性心臟病，白血病高風(fēng)險(xiǎn)為主要臨床表現(xiàn)。隨著年齡的增長(zhǎng)，罹患DS的病人大腦中都不可避免地檢測(cè)到類(lèi)似于阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)的神經(jīng)病理特征，包括神經(jīng)毒性斑塊，神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元死亡。因此，通過(guò)研究DS的分子病理基礎(chǔ)以探尋AD的發(fā)病機(jī)制是很有意義的。DS的遺傳學(xué)病因主要是攜帶了三倍體的

2、21號(hào)染色體的全長(zhǎng)或部分，位于21號(hào)染色體的21q22.1～21q22.3區(qū)域被稱(chēng)為“唐氏綜合癥關(guān)鍵區(qū)域(Downsyndromecriticalregion，DSCR)”，DSCR1是臨近這個(gè)區(qū)域21q22.12所表達(dá)的蛋白，其過(guò)量表達(dá)被認(rèn)為是DS癥狀的主要分子病理病因。
　　DSCR1又被稱(chēng)為鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)因子1(Regulatorofcalcineurin1，RCAN1)，其可與酶亞基A相互結(jié)合，從而降低了鈣調(diào)磷酸酶的活性，

3、導(dǎo)致下游底物活化T細(xì)胞核因子(NuclearfactorofactivatedTcells，NFAT)脫磷酸化作用減弱，不能轉(zhuǎn)移到核內(nèi)。RCAN1-鈣調(diào)磷酸酶-NFAT信號(hào)通路失衡被認(rèn)為與DS發(fā)病的分子機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，DS患者大腦中鈣調(diào)磷酸酶的活性明顯降低，同樣，在AD患者中鈣調(diào)磷酸酶的活性也顯著下降，致使tau蛋白高度磷酸化，形成具有AD病理特征性的神經(jīng)纖維纏結(jié)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在DS和AD患者大腦中RCAN1均被檢測(cè)到有過(guò)量表達(dá)，約為

4、正常人的2～3倍。這些研究均提示RCAN1可能在DS和AD的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。
　　具有神經(jīng)毒性的β淀粉樣蛋白(Amyloid-βpeptide，Aβ)在腦中的沉積被認(rèn)為是AD的標(biāo)志性病理現(xiàn)象之一。Aβ主要是由β分泌酶和γ分泌酶依次酶切β淀粉樣蛋白前體蛋白(Amyloid-βprecursorprotein，APP)而產(chǎn)生。β分泌酶1(Beta-siteAPP-cleavingenzyme1，BACE1)是最主要的β分泌酶，其

5、可酶切APP的兩個(gè)位點(diǎn)形成具有99或89個(gè)氨基酸的C末端片段(C99，C89)，在病理情況下，C99被γ分泌酶進(jìn)一步酶切，產(chǎn)生Aβ和C末端小片段。而在生理情況下，APP主要由α分泌酶在Aβ區(qū)域內(nèi)部酶切，形成具有83個(gè)氨基酸的C末端片段(C83)，C83進(jìn)而被γ分泌酶酶切，生成無(wú)毒性的p3和C末端小片段。BACE1從產(chǎn)生到成熟經(jīng)歷了復(fù)雜的翻譯后加工過(guò)程，其中包括了4個(gè)位點(diǎn)的N端糖基化(Asn153，172，223，354)。γ分泌酶是一組

6、蛋白復(fù)合體，其中多個(gè)亞基同樣為N端糖基化蛋白。研究表明，BACE1的糖基化程度與其成熟度和活性密切相關(guān)，而γ分泌酶亞基的成熟度下降也會(huì)導(dǎo)致整個(gè)復(fù)合體的酶活性降低。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在DS患者中，成熟型的BACE1過(guò)量表達(dá)，可能是導(dǎo)致DS患者腦中Aβ沉積，出現(xiàn)類(lèi)似于AD的癡呆癥狀的主要原因。然而，導(dǎo)致成熟型的BACE1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚不清楚。
　　RCAN1已被認(rèn)為和神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元凋亡等多種神經(jīng)退行性病變的分子病理機(jī)制相關(guān)。我們的研究

7、發(fā)現(xiàn)，上調(diào)RCAN1可以促使BACE1和γ分泌酶活性亞基NCT(Nicastrin)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N端糖基化增加，成熟形態(tài)的蛋白過(guò)度表達(dá)。N端糖基化是一種復(fù)雜的翻譯后加工過(guò)程，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要受到寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(Oligosaccharyltransferase，OST)調(diào)控。OST主要催化核心寡糖鏈轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新合成肽鏈的天冬酰胺殘基上形成N-糖苷鍵，從而完成了N端糖基化的起始關(guān)鍵步驟之一。本研究發(fā)現(xiàn)RCAN1可以與OST的亞基之一，

8、核糖體結(jié)合蛋白1(RibophorinⅠ，RPNⅠ)直接作用，上調(diào)了OST的酶活性。因此高表達(dá)RCAN1可以促使多種N端糖基化蛋白成熟度增加，過(guò)度成熟的BACE1和NCT均參與了對(duì)APP的酶切過(guò)程，最終導(dǎo)致Aβ的表達(dá)上升，產(chǎn)生一系列的神經(jīng)退行性癥狀。
　　本文進(jìn)一步闡明了RCAN1在DS發(fā)病中的關(guān)鍵作用，為探討AD的分子病理基礎(chǔ)提供了一條新思路。本研究不僅從一個(gè)新的角度詮釋了RCAN1這一高度保守的關(guān)鍵基因在生命體中的重要功能，也

9、對(duì)治療AD患者的臨床癥狀提供了一個(gè)新的藥物靶點(diǎn)。
　　第一部分RCAN1上調(diào)BACE1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N端糖基化
　　為了驗(yàn)證RCAN1是否影響B(tài)ACE1的糖基化，我們首先在體外實(shí)驗(yàn)中使用pRCAN1-myc和pBACE1-mycHis質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。人類(lèi)BACE1含有4個(gè)N端糖基化位點(diǎn)，由于糖基化程度的不同，在SDS-PAGEWestenBlot檢測(cè)中呈現(xiàn)出成熟型和非成熟型兩條條帶。我們發(fā)現(xiàn)RCAN1對(duì)成熟型和非

10、成熟型的BACE1都有顯著的上調(diào)作用。同時(shí)，使用N端糖基化阻斷劑衣霉素(Tunicamycin)可以完全阻斷BACE1成熟型和非成熟型蛋白的生成，使之轉(zhuǎn)化成非糖基化的蛋白形態(tài)，提示成熟型和非成熟型BACE1蛋白均含有N端糖基化修飾。但是，使用小干擾RNA(Si-RNA)干擾RCAN1的表達(dá)之后，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BACE1的表達(dá)有明顯下降。
　　N端糖基化修飾發(fā)生于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中。我們使用了兩種不同的糖苷酶——糖苷內(nèi)切酶H(end

11、o-glycosidaseH，EndoH)和肽N端糖苷內(nèi)切酶F(Peptide-N-Glycosidase-F,PNGaseF)來(lái)檢測(cè)RCAN1對(duì)BACE1N端糖基化影響的定位。EndoH可以水解在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)加上的高甘露糖鏈和部分N端雜糖鏈，而PNGaseF可以水解幾乎所有的復(fù)雜N端糖鏈。經(jīng)糖苷酶處理后，PNGaseF將BACE1完全酶切成非糖基化形態(tài)，而EndoH則僅將非成熟的BACE1酶切成低糖基化形態(tài)，同時(shí)RCAN1對(duì)成熟型BACE

12、1的上調(diào)作用消失，提示RCAN1對(duì)BACE1的調(diào)控作用主要發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，我們使用蔗糖密度梯度離心法分離了細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，非成熟型的BACE1僅存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，且RCAN1的上調(diào)作用仍然十分顯著。這些結(jié)果提示RCAN1主要影響了BACE1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N端糖基化。
　　第二部分RCAN1對(duì)蛋白糖基化的調(diào)控作用具有非特異性
　　為了探討RCAN1對(duì)BACE1糖基化的影響是否具有特異性，我們引入了

13、另外兩種N端糖基化蛋白——BACE2和NCT。其中，BACE2是BACE1的同源異構(gòu)體，NCT是γ分泌酶亞基之一，二者均影響Aβ的生成。WesternBlot顯示RCAN1上調(diào)了BACE2和NCT的蛋白水平，衣霉素同樣可以使BACE2和NCT轉(zhuǎn)化成非糖基化形態(tài)。PNGaseF處理可以使BACE2轉(zhuǎn)化成非糖基化形態(tài)，而EndoH可以將BACE2酶切成低糖基化形態(tài)，提示BACE2和BACE1一樣具有復(fù)雜的N端糖基化修飾。而PNGaseF和E

14、ndoH均能將NCT水解成非糖基化形態(tài)，提示NCT的糖基化修飾完全存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。使用蔗糖密度梯度離心法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RCAN1對(duì)BACE2和NCT蛋白的上調(diào)作用主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。以上結(jié)果提示RCAN1對(duì)蛋白糖基化的調(diào)控具有非特異性。
　　第三部分RCAN1上調(diào)β分泌酶和γ分泌酶的活性進(jìn)而增加β淀粉樣蛋白的生成
　　為了研究RCAN1對(duì)BACE1和NCT的糖基化調(diào)控是否影響了β分泌酶和γ分泌酶的活性，我們用pBACE1-myc

15、His和pAPP-myc和質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RCAN1可以顯著增加β分泌酶酶切產(chǎn)物C99的表達(dá)，這種上調(diào)作用在使用Si-NCT抑制γ分泌酶活性的情況下依然存在，提示RCAN1增強(qiáng)了BACE1的酶切活性。Norch蛋白是γ分泌酶的主要作用底物之一，為了驗(yàn)證RCAN1是否對(duì)γ分泌酶活性產(chǎn)生影響，我們構(gòu)建了對(duì)Norch信號(hào)通路有指示作用的HES-1質(zhì)粒。對(duì)HES-1的啟動(dòng)子活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RCAN1對(duì)γ分泌酶的活性有顯著的上調(diào)作

16、用。
　　為了進(jìn)一步檢測(cè)RCAN1對(duì)β分泌酶和γ分泌酶的影響是否促進(jìn)了下游酶切產(chǎn)物Aβ的生成，我們使用8Mureatricinegel來(lái)分離并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的Aβ含量。研究發(fā)現(xiàn)，RCAN1明顯上調(diào)了Aβ40和Aβ42的蛋白水平。同樣，使用ELISA法也證實(shí)RCAN1可以促使Aβ40的表達(dá)增加。以上結(jié)果說(shuō)明RCAN1通過(guò)上調(diào)β分泌酶和γ分泌酶的活性增加了Aβ的生成。
　　第四部分RCAN1可以與OST的亞基RPNⅠ直接作用從

17、而上調(diào)OST的酶活性
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證RCAN1同樣可以影響其他糖基化蛋白的糖基化修飾，我們使用了Pro-QEmerald糖蛋白檢測(cè)法和刀豆蛋白A來(lái)顯示全細(xì)胞糖蛋白。Pro-QEmerald檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RCAN1的細(xì)胞中糖蛋白的信號(hào)明顯增強(qiáng)，而刀豆蛋白AWesternBlot顯示糖蛋白的表達(dá)增加主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而非高爾基體中，進(jìn)一步驗(yàn)證了RCAN1對(duì)糖蛋白的調(diào)控作用是非特異的。我們進(jìn)而合成了具有N端糖基化位點(diǎn)的多肽GNSTVT，

18、采用洋地黃毛苷(Digitonin)半通透法將其轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞內(nèi)。我們發(fā)現(xiàn)RCAN1明顯上調(diào)了多肽的糖基化形態(tài)，進(jìn)一步提示了RCAN1對(duì)糖基化蛋白的影響是普遍存在的。
　　N端糖基化是一種復(fù)雜的翻譯后修飾過(guò)程，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的核心步驟由OST催化完成。我們構(gòu)建了OST的亞基質(zhì)粒STT3A，RPNⅠ，RPNⅡ和OSTC，與RCAN1共轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)，盡管OST核心組分的STT3A的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，RPNⅠ，RPNⅡ和OSTC的表達(dá)都有上

19、升。有趣的是，阻斷RCAN1的表達(dá)也觀察到了RPNⅠ，RPNⅡ和OSTC這三個(gè)OST亞基的表達(dá)下降。最近的研究發(fā)現(xiàn)，OST單一亞基的下調(diào)可以影響其他亞基的功能，從而導(dǎo)致整個(gè)OST的活性下降。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，上調(diào)任何一個(gè)OST亞基的表達(dá)均能對(duì)增加BACE1成熟和非成熟形態(tài)的表達(dá)，以非成熟形態(tài)更為顯著，類(lèi)似于上調(diào)RCAN1的作用效果。因此，RCAN1可能影響了OST的穩(wěn)定性進(jìn)而對(duì)N端糖基化修飾產(chǎn)生影響。
　　為了證實(shí)RCAN1是否與OS

20、T有直接關(guān)聯(lián)，我們使用了co-IP方法來(lái)檢測(cè)RCAN1和OST亞基的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有RPNⅠco-IP檢測(cè)到了RCAN1的蛋白條帶。RPNⅠ可以調(diào)控底物遞呈給OST核心組分的過(guò)程，一些分泌蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin）的糖基化修飾不受RPNⅠ調(diào)控。WesternBlot檢測(cè)顯示，僅OST的核心組分STT3A的上調(diào)促進(jìn)了Transferrin的表達(dá)，RPNⅠ，RPNⅡ和OSTC都未對(duì)Transferrin的表達(dá)產(chǎn)生影響。

21、同樣，上調(diào)RCAN1沒(méi)有檢測(cè)到Transferrin的表達(dá)變化。因此我們推測(cè)RCAN1對(duì)OST的調(diào)控主要是通過(guò)和RPNⅠ的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　綜上所述
　　1、本研究證實(shí)了RCAN1對(duì)OST有調(diào)控作用，這種調(diào)控作用是通過(guò)和OST亞基RPNⅠ的直接作用，增強(qiáng)了OST的穩(wěn)定性和活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。OST由多個(gè)亞基組成，其核心成分為STT3A，我們的研究發(fā)現(xiàn)RCAN1對(duì)STT3A的作用不顯著，提示RCAN1可能是OST的非核心組分。

22、
　　2、通過(guò)對(duì)OST的調(diào)控作用，RCAN1的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)一系列蛋白的糖基化修飾過(guò)程，包括BACE1，BACE2和NCT。同樣RCAN1可以影響具有N端糖基化位點(diǎn)多肽GNSTVT的成熟形態(tài)表達(dá)，但對(duì)僅受OST核心組分STT3A調(diào)控的分泌蛋白Transferrin的作用效果不大。
　　3、RCAN1通過(guò)上調(diào)β分泌酶和γ分泌酶糖基化修飾，使其成熟度和酶切活性增高，增加了Aβ的生成，導(dǎo)致DS患者出現(xiàn)類(lèi)似于AD的癡呆和認(rèn)知功能障礙