金黃色葡萄球菌腸毒素B突變體(N23S,H32N和K172E)的構(gòu)建及其對(duì)肉雞免疫佐劑作用的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)是由金黃色葡萄球菌分泌產(chǎn)生的一種外毒素，也是一種超抗原。SEB能夠非特異性地激活免疫細(xì)胞，尤其是T細(xì)胞。產(chǎn)生眾多細(xì)胞因子，能夠提高特異性抗原的免疫原性。因而SEB具備成為免疫佐劑的潛力。但由于SEB對(duì)人和哺乳動(dòng)物具有較大的毒副作用，因此其佐劑活性在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。為了減輕或消除SEB的毒性作用，我們通過PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建SEB突變體(N23S，H32N和K172E)，篩選出超抗原活性較好

2、的突變體。同時(shí)研究SEB及其突變體在肉雞體內(nèi)的安全性及其佐劑活性，為促進(jìn)SEB作為免疫佐劑在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)主要包括三個(gè)部分工作:
　　1.獲得SEB突變重組蛋白
　　利用PCR方法對(duì)SEB的3個(gè)關(guān)鍵抗原位點(diǎn)進(jìn)行突變，包括N23S，H32N和K172E，并構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-SEB，pET-28a-SEBM23(N23S)，pET-28a-SEBM32(H32N), pET-28a-SEBM172

3、(K172E), pET-28a-SEBM23/172(N23S+K172E), pET-28a-SEBM32/172(H32N+K172E), pET-28a-SEBM23/32/172(N23S+H32N+K172E).在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得7種重組蛋白。
　　2.SEB及其突變體SEBM32/172對(duì)AIV-H9/NDV二聯(lián)滅活苗的佐劑作用
　　分別用重組蛋白SEB和SEBM32/172配合H9亞型禽流感、新城

4、疫二聯(lián)滅活苗免疫肉雞，通過HI實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)SEB及其突變體SEBM32/172對(duì)滅活疫苗的佐劑作用。結(jié)果顯示在免疫后第14-28天5μg SEBM32/172能不同程度的提高滅活疫苗中AIV-H9的免疫效果，對(duì)NDV的作用不明顯;1μg或10μg SEBM32/172和SEB的對(duì)滅活疫苗的佐劑效應(yīng)不穩(wěn)定。淋巴細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示1μg SEB和5μgSEBM32/172在免疫后第7天顯著高于疫苗對(duì)照組，其他時(shí)間段存在一定差異。<

5、br>　　3.SEB及其突變體SEBM32/172在肉雞體內(nèi)的安全性評(píng)價(jià)
　　為了研究突變SEBM32/172后能否降低SEB對(duì)機(jī)體毒性作用，我們用10倍佐劑劑量（50μg/只）的重組蛋白SEB和SEBM32/172分別肌肉注射肉雞，分別在接種后第7、14、21天進(jìn)行剖檢取樣制備組織病理切片，進(jìn)行病理學(xué)觀察。在試驗(yàn)過程中肉雞表現(xiàn)正常，臟器沒有明顯的肉眼可見的組織病變，但在顯微鏡下，實(shí)驗(yàn)組肉雞的腎臟存在不同程度的病理損傷，如腎小管變