腫瘤抗原MAGE-4 HLA-A2-A3限制性CTL表位的預(yù)測(cè)、合成及鑒定.pdf

1、背景和目的:目前惡性腫瘤已經(jīng)嚴(yán)重的威脅著我國(guó)人民的身體健康,腫瘤治療的基本手段包括傳統(tǒng)的外科手術(shù)、放療和化療等,治療效果較為明顯。由于放療和化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺傷正常細(xì)胞,因此對(duì)患者本身的損傷亦較大,降低了患者的生活質(zhì)量,生物治療目前已經(jīng)成為傳統(tǒng)療法的必要補(bǔ)充。食管癌是我國(guó)華北地區(qū)發(fā)病率較高的惡性腫瘤,雖然對(duì)放療較為敏感,但是由于其獨(dú)特的生物學(xué)特性,其對(duì)化療的敏感性較低,目前手術(shù)仍然是改善患者預(yù)后和提高生存率的主要手段。由于惡性

2、腫瘤本身的一些特性即易侵襲和復(fù)發(fā),使患者術(shù)后5年生存率低于10％,因此尋找新的抗腫瘤方法是近幾年來研究的熱點(diǎn)之一。近幾十年來由于免疫學(xué)的發(fā)展,人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到人體自身的免疫系統(tǒng)在抗腫瘤方面發(fā)揮的作用。免疫治療作為一種新的生物治療手段,在惡性腫瘤的治療中正在發(fā)揮積極的作用。尋找腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)性抗原對(duì)于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療極為重要。隨著對(duì)免疫應(yīng)答分子機(jī)制的深入研究,人們認(rèn)識(shí)到機(jī)體的免疫細(xì)胞并非一一對(duì)應(yīng)于各種抗原,而是針

3、對(duì)各種各樣抗原分子的抗原表位。表位是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán),也是TCR/BCR和抗體特異性結(jié)合的基本單位,因而表位在抗原中起著關(guān)鍵性作用。發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的腫瘤抗原表位就有可能研制出針對(duì)該抗原的特異性抗體或者是疫苗,現(xiàn)在已經(jīng)明確,基于被特異性T細(xì)胞所識(shí)別的腫瘤抗原表位疫苗作為抗腫瘤的新一代疫苗,有著誘人的應(yīng)用前景,因此發(fā)現(xiàn)并鑒定各種抗原來源的T細(xì)胞表位已經(jīng)成為分子免疫學(xué)領(lǐng)域的熱門課題之一。黑色素瘤抗原(MAGE)是首先從黑色素

4、瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關(guān)性抗原。MAGE在正常組織中(除睪丸和胚胎外)均不表達(dá),主要表達(dá)于惡性腫瘤組織中,其表達(dá)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系十分密切。研究發(fā)現(xiàn),MAGE基因在多種消化道腫瘤中有不同程度的表達(dá),其基因產(chǎn)物是一種腫瘤排斥抗原,可在腫瘤細(xì)胞表面與人類白細(xì)胞抗原(HLA)分子結(jié)合,由CTL識(shí)別,產(chǎn)生特異性效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞。MAGE基因家族成員之一MAGE-4在食管鱗癌(74%),肺癌(59%),頭頸部腫瘤(53%),膀胱癌(45%

5、)表達(dá)程度較高。Zambon等研究發(fā)現(xiàn)67%食管鱗癌和37.5%的食管腺癌中至少表達(dá)一種MAGE基因,其中MAGE-4更多見于鱗癌組織中,因此MAGE-4可以作為食管鱗狀細(xì)胞癌的一個(gè)特異性指標(biāo),尋找MAGE-4 HLA限制性表位,將為食管癌及其它惡性腫瘤的生物治療提供一定的理論依據(jù)。
　　方法:1.利用Internet網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入SYFPEITHI在線預(yù)測(cè)主頁(http://www.syfpeithi.de/scriots/MHCSe

6、rver.dll/home.htm),點(diǎn)擊“Epitope prediction”進(jìn)入預(yù)測(cè)界面,選擇“HLA-A~*0201”及“HLA-A~*03”分別對(duì)目的抗原進(jìn)行表位預(yù)測(cè)。選擇分值超過20的九肽,運(yùn)用蛋白酶體裂解基序(Proteasomal cleavage motifs)的預(yù)測(cè)方案(NetChop3.0)分析工具,以FASTA格式輸入目的抗原序列,進(jìn)行C-端酶切位點(diǎn)分析。然后再利用基于結(jié)構(gòu)的表位預(yù)測(cè)算法(MHC-Pred)工具進(jìn)

7、行結(jié)構(gòu)親和性分析。2.按照標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相合成方法進(jìn)行多肽合成,高效液相色譜法(HPLC)純化合成出的候選肽,電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)鑒定其分子量。3.RT-PCR法檢測(cè)MAGE-4的mRNA在三種腫瘤細(xì)胞EC-1、EC-109和EC-9706中的表達(dá)情況。4.運(yùn)用T2細(xì)胞株結(jié)合力實(shí)驗(yàn)分析候選肽與HLA-A2/A3分子的結(jié)合力。5.選取高結(jié)合力的肽誘導(dǎo)出特異性CTL細(xì)胞,MTT法檢測(cè)其殺傷毒性。
　　結(jié)果:1.綜合運(yùn)用生物信息

8、學(xué)方法預(yù)測(cè)出分值比較高的5條肽作為腫瘤相關(guān)抗原肽MAGE-4的候選表位肽。2.標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相合成法合成篩選出的5條表位肽,HPLC純化,其純度大于90%,質(zhì)譜分析結(jié)果顯示實(shí)際分子量與理論分子量相符。3.RT-PCR檢測(cè)出3種腫瘤細(xì)胞均表達(dá)MAGE-4,其中EC-109中MAGE-4的表達(dá)量明顯弱于EC-1和EC-9706。4.所有候選肽與HLA-A2分子均沒有結(jié)合力,P22(ALGLVGAQA)與P286(KVLEHVVRV)與HL

9、A-A3有弱結(jié)合力(FI=0.81,FI=0.84)。5.P22和P286誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞EC-1、EC-9706有明顯的殺傷活性,P22對(duì)腫瘤細(xì)胞EC-1、EC-9706的殺傷率分別為55.13±5.07%和62.66±2.49%,P286對(duì)腫瘤細(xì)胞EC-1、EC-9706的殺傷率分別為59.02±1.83%和62.17±2.82%,而對(duì)MAGE-4表達(dá)量弱的EC-109殺傷活性較低(P<0.05)。
　　結(jié)論:P2