表達亞洲1型口蹄疫病毒P1-2A3C基因的山羊痘病毒弱毒株構建及其復制非必需區(qū)篩選.pdf

1、羊痘(Capripox,CP)是由綿羊痘病毒(Sheeppoxvirus,SPPV)和山羊痘病霉(Goatpoxvirus,GTPV)引起的綿羊和山羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病.病畜以體溫升高,全身性丘疹或結節(jié)、水皰、內臟病變乃至死亡為特征.口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth diseaSe vims,FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病.口蹄疫和羊

2、痘都是危害性非常嚴重的疾病,均被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類重大傳染病.本文利用已在我國廣泛使用的山羊痘弱毒疫苗株(AV41),利用病毒在細胞內的同源重組,構建表達Asial型口蹄疫P1-2A和3C基因的重組山羊痘病毒弱毒株.為了構建表達多個外源基因的重組山羊痘弱毒株,文中還采用隨機克隆的方法,篩選出該毒株(AV41)的一個復制非必需區(qū). 1.選擇胸苷激酶(Thymidine kinase,TK)基因區(qū)域作為外源基因插入位

3、點構建重組病毒.提取GTPvAV41株基因組DNA,設計特異性引物擴增TK基因及其兩側翼片段,獲得了長度為2078bp的TK基因及兩側的同源臂.其中TK基因的ORF為534bp,編碼178個氨基酸.核苷酸和氨基酸同源性分析表明,GTPVAV41株TK基因與參考毒株的核苷酸和氨基酸的同源性在95.5﹪-100.0﹪之間,說明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性. 2.為了使重組病毒能高效表達外源基因,構建一個真核生物基因表達盒P7.5

4、-EGFP-P,通過痘苗病毒P7.5啟動子來啟動綠色熒光蛋白和FMDV Asial/YNBS-58株衣殼蛋白前體P1-2A3C的表達.以山羊痘病毒TK基因序列中的kpn I酶切位點為插入點,將整體表達盒插入山羊痘病毒轉移載體骨架pUC119-TK 之中,構建了共表達FMDV P1-2A3C基因和綠色熒光蛋白基因的重組山羊痘病毒轉移載體pTK-P7.5-EGFP-P. 3.病毒轉移載體pTK-P7.5-EGFP-P轉染GTPV A

5、V41株感染的BHK-21細胞,轉染后24h就可見到特異性熒光.經綠色熒光篩選重組病毒,RT-PCR檢測 FMDV P1-2A、3C基因,抗原捕獲ELISA檢測 FMDV 抗原,結果表明,成功獲得了能穩(wěn)定、正確表達目的蛋白的重組山羊痘病毒株TK<'->/EGFP<'+>/FMDV P1-2A3C<'+>/GTPV.毒價測定結果表明,重組毒在BHK-21細胞上的霉價為10<'5.5>TCID<,50>/0.1mL. 4.提取 GT

6、PV AV41 株病毒基因組用 HindⅢ酶切,酶切片段克隆到pUC18質粒中,得到6個不同大小的HindⅢ片段Puc18-A、Puc18-B、Puc18-C、Puc18-D、Puc18-E和Puc18-F,分別插入P7.5-P7.5-Lacz報告基因構建了PUA1,PUB1,PUC1,PUD1,PUE1,PUF1等6個重組轉移載體質粒,轉移載體轉染GTPVAV41株感染的BHK-21細胞.在X-gal存在條件下通過藍白斑篩選,獲得了一