地錢素C和褐藻多糖對(duì)膠質(zhì)瘤微球環(huán)境中血管生成的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的成人顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，盡管存在手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)藥物治療等多種治療手段，仍然是人類最為難治的腫瘤之一。做為其中惡性程度較高的一種亞型，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的5年期生存率不足3％。其難治性的主要原因之一在于膠質(zhì)瘤組織中過度的病理性血管生成。過度血管生成是大多數(shù)惡性腫瘤的生物學(xué)特征并且在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中與其惡性程度相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道在膠質(zhì)瘤的一種亞型星形細(xì)胞瘤中，惡性程度高的腫瘤呈現(xiàn)出較高的微血管

2、密度。
　　 血管生成過程處于體內(nèi)一系列具有促進(jìn)或者抑制作用的細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)之下。在這一高度復(fù)雜的生理或者病理過程中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)做為一種重要的促血管生成細(xì)胞因子受到廣泛關(guān)注，并被認(rèn)為在血管生成的調(diào)節(jié)過程處于中心地位。與血管生成相似，有報(bào)道稱膠質(zhì)瘤組織中VEGF的濃度與其惡性程度直接相關(guān)。
　　 在膠質(zhì)瘤組織微環(huán)境中，膠質(zhì)瘤細(xì)胞和外

3、周浸潤(rùn)來的髓樣細(xì)胞均是VEGF的重要來源。盡管髓樣細(xì)胞所占比例遠(yuǎn)小于膠質(zhì)瘤細(xì)胞，但它在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮的作用是不可替代的，這可能是由于髓系來源的VEGF-A(VEGF的一種亞型)對(duì)于VEGF受體2的磷酸化的獨(dú)特作用，而VEGF受體2正是VEGF作用于內(nèi)皮細(xì)胞從而介異血管生成的主要受體。
　　 在過去幾十年中，研究者們逐步認(rèn)識(shí)到抗血管生成療法是一處有效的抗腫瘤措施，也有多種抗血管生成藥物表現(xiàn)出良好的腫瘤治療效果。這些產(chǎn)品主要

4、針對(duì)性作用于VEGF的信號(hào)傳導(dǎo)過程，包括VEGF抗體如貝伐單抗(bevacizumab)，VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑如舒尼替尼(sunitinib)、西地尼布(cediranib)以及VEGF假受體(VEGF-TRAP)等。抗血管生成藥物主要通過兩種方式影響腫瘤的生長(zhǎng)。首先，通過阻斷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的運(yùn)輸抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng);其次，抗血管生成藥物能夠使得異常迂曲的腫瘤血管網(wǎng)獲得短暫的正?；瑥亩鰪?qiáng)同步應(yīng)用的放射療法或者化學(xué)藥物療法的療效

5、。盡管許多研究已經(jīng)證實(shí)了這些抗血管生成療法在改善患者預(yù)后方面的有效性，但上述抗血管生成藥物的作用仍不能令人滿意，一些毒副作用如高血壓、蛋白尿及血栓栓塞事件仍時(shí)有發(fā)生。因此，一種新型的內(nèi)源性抗血管生成因子——可溶性內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(soluble VEG Freceptor1，sFlt-1)——越來越多的受到研究者們的關(guān)注。
　　 sFlt-1由Kendall等人于1993年克隆發(fā)現(xiàn)，是膜結(jié)合型VEGF受體1的一種特殊剪切體

6、。在結(jié)構(gòu)上與膜結(jié)合型VEGF受體1相比，sFlt-1保留了與配體結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域，但缺少跨膜及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。因此，sFlt-1雖能夠與配體VEGF結(jié)合但不能產(chǎn)生胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，加之sFlt-1與VEGF-A的親和力遠(yuǎn)大于VEGF受體2，就形成了對(duì)VEGF與其受體2結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。另外，sFlt-1還可與膜型VEGF受體形成異二聚體，阻斷受體自身的磷酸化，以顯性負(fù)性復(fù)合體的形式阻斷VEGF信號(hào)的傳導(dǎo)。在人體內(nèi)，sFlt-1主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞

7、產(chǎn)生，但有些腫瘤細(xì)胞如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和髓系細(xì)胞如單核細(xì)胞也是sFlt-1的來源。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤方面，有文獻(xiàn)報(bào)道sFlt-1與其組織內(nèi)的VEGF濃度、微血管密度、腫瘤的惡性程度及其預(yù)后相關(guān)。也有數(shù)項(xiàng)靶向基因治療研究證實(shí)了其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療方面的有效性。Harding等人以rAAV為載體將sVEGFR1/R2轉(zhuǎn)入皮下移植膠質(zhì)瘤模型中，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯縮小，宿主生存期明顯延長(zhǎng)，而將此載體直接注入顱內(nèi)原位膠質(zhì)瘤中能起到比全身應(yīng)用更好的效果。Gol

8、dman等人用轉(zhuǎn)染有sFlt-1基因的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞建立顱內(nèi)原位膠質(zhì)瘤模型發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染有sFlt-1基因的小鼠預(yù)后明顯更佳。
　　 地錢素C(marchantin C)是一種專門從地錢類植物中提出的大環(huán)雙聯(lián)苯類化合物的家庭成員，目前的研究顯示它們具有多種生物學(xué)功能，如細(xì)胞毒、抗腫瘤及抗真菌等。地錢素C作為成員之一其具體的生物學(xué)作用尚未得到深入研究，但目前研究結(jié)果中顯示的對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲的抑制以及對(duì)腫瘤微管的抑

9、制提示了其做為抗膠質(zhì)瘤治療藥物的較大潛力。褐藻多糖(fucoidan)是一種富含L-巖藻糖(L-fucose)和酯基的硫酸多糖，提取自褐藻類植物和海膽等海洋無脊椎動(dòng)物，又稱為聚海藻糖、巖藻聚糖或者硫酸聚海藻糖。褐藻多糖同樣具有多樣的生物學(xué)功能，包括抗凝血、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗自由基、抗補(bǔ)體及抗炎癥等作用。到目前為止，還未見有關(guān)地錢素C或者褐藻多糖對(duì)sFlt-1產(chǎn)生的影響方面的報(bào)道，而已有的研究結(jié)果表明這兩種藥物具有抗血管生成的作

10、用。因此在本研究中，我們選擇這兩種藥物研究它們對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤微環(huán)境中兩種主要的VEGF來源細(xì)胞膠質(zhì)瘤細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌sFlt-1的影響以及進(jìn)一步的對(duì)這兩種細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成的影響，以求尋找一種更加安全有效的抗血管生成策略以對(duì)抗惡性膠質(zhì)瘤。
　　 第一部分:地錢素C對(duì)膠質(zhì)瘤微環(huán)境中血管生成的影響及機(jī)制研究
　　 研究目的：
　　 1.研究地錢素C對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sFlt-1的影響。

11、
　　 2.研究地錢素C對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的血管生成的影響。
　　 3.研究sFlt-1在地錢素C影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的血管生成過程中的作用。
　　 4.研究地錢素C影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sFlt-1的相關(guān)細(xì)胞因子和機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.地錢素C對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sF

12、lt-1的影響。取生長(zhǎng)良好的T98G和THP1細(xì)胞以每孔105個(gè)細(xì)胞加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，12h后加入不同濃度的地錢素C（終濃度分別為1μM、5μM、10μM），繼續(xù)培養(yǎng)6h，12h，24h。刺激結(jié)束后收集條件刺激上清行ELlSA檢測(cè)sFlt-1的表達(dá)水平。
　　 2.地錢素C對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的血管生成的影響。
　　 T98G細(xì)胞和THP1細(xì)胞經(jīng)地錢素C(5μM)刺激24h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)

13、行HUVEC成管功能試驗(yàn)。96孔板每孔鋪基質(zhì)膠70μl，每孔加入等量細(xì)胞懸液和條件上清的混合液200μl，每孔細(xì)胞數(shù)105個(gè)，6h后顯微鏡下拍照記錄。取每孔三個(gè)視野內(nèi)分散的內(nèi)皮細(xì)胞形成的管狀結(jié)構(gòu)間分叉點(diǎn)的數(shù)目的平均值對(duì)成管能力進(jìn)行定量計(jì)算。
　　 3.sFlt-1在地錢素C影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的血管生成過程中的作用。
　　 T98G細(xì)胞和THP1細(xì)胞經(jīng)地錢素C(5μM)刺激24h后取細(xì)胞培養(yǎng)

14、上清進(jìn)行HUVEC成管功能試驗(yàn)。設(shè)對(duì)照組，藥物刺激組和抗體處理組。藥物刺激組為藥物刺激后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，對(duì)照組為未經(jīng)藥物刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入與刺激量相同的地錢素C，抗體處理組為在藥物刺激后的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入2μg/ml的sFlt-1特異性阻斷抗體并室溫孵育0.5h。96孔板每孔鋪基質(zhì)膠70μl，每孔加入等量細(xì)胞懸液和條件上清的混合液200μl，每孔細(xì)胞數(shù)105個(gè)，6h后顯微鏡下拍照記錄。取每孔三個(gè)視野內(nèi)分散的內(nèi)皮細(xì)胞形成的管狀結(jié)構(gòu)

15、間分叉點(diǎn)的數(shù)目的平均值對(duì)成管能力進(jìn)行定量計(jì)算。
　　 4.地錢素C影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sFlt-1的相關(guān)細(xì)胞因子和機(jī)制。
　　 1)T98G細(xì)胞和THP1細(xì)胞經(jīng)地錢素C(5μM)刺激24h后收集細(xì)胞提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄后行Real-timePCR檢測(cè)sFlt-1mRNA的表達(dá)。
　　 2)T98G細(xì)胞和THP1細(xì)胞經(jīng)地錢素C(5μM)刺激24h后收集細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜上VEG

16、FR1的表達(dá)。
　　 3)T98G細(xì)胞和THP1細(xì)胞經(jīng)地錢素C(5μM)刺激24h后收集細(xì)胞提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄后行Real-timePCR檢測(cè)MMP-2，7，9，12mRNA的表達(dá)。
　　 4)取生長(zhǎng)良好的T98G和THP1細(xì)胞以每孔105個(gè)細(xì)胞加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，12h后分別加入終濃度為20μM的ERK1/2信號(hào)通路阻斷劑U0126或10μM的p38信號(hào)通路阻斷劑SB203580，24h后收集細(xì)胞行Real-time

17、PCR檢測(cè)MMP-7mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.地錢素C對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sFlt-1的影響。在24h作用時(shí)間下，隨著藥物濃度的增高，T98G細(xì)胞的sFlt-1的分泌水平呈先上升后下降的趨勢(shì)，THP1細(xì)胞的sFlt-1的分泌水平卻無顯著性變化。選擇5μM的作用濃度，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，T98G細(xì)胞的sFlt-1的分泌水平呈逐漸上升的趨勢(shì)，THP1細(xì)胞的sFlt-1的分泌水平仍無

18、顯著性變化。
　　 2.地錢素C對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的血管生成的影響。
　　 地錢素C能夠抑制T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成，而sFlt-1分泌水平無顯著變化的THP1單核細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成卻無顯著變化。對(duì)成管能力的定量分析也進(jìn)一步明確了地錢素C對(duì)T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成具有顯著的抑制作用。
　　 3.sFlt-1在地錢素C影響人腦膠質(zhì)癌細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的

19、血管生成過程中的作用。
　　 與對(duì)照組相比，地錢素C刺激后(5μM，24h)的T98G細(xì)胞條件培養(yǎng)上清明顯抑制了HUVEC的成管能力，經(jīng)sFlt-1特異性抗體的免疫性清除后其成管能力有顯著的恢復(fù)，達(dá)到與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?。?duì)成管能力的定量分析進(jìn)一步明確了這一作用。
　　 4.地錢素C影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sFlt-1的相關(guān)細(xì)胞因子和機(jī)制。
　　 1)地錢素C刺激后的T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞的s

20、Flt-1mRNA水平下降。
　　 2)VEGFR1在T98G細(xì)胞膜表達(dá)量極少，地錢素C對(duì)此無影響。
　　 3)地錢素C刺激后的T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MMP-7的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，而MMP-2，9，12則未見明顯變化。
　　 4)ERK1/2信號(hào)通路的阻斷劑U0126能顯著抑制MMP-7的轉(zhuǎn)錄，而p38信號(hào)通路的阻斷劑SB203580卻對(duì)T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MMP-7的轉(zhuǎn)錄無明顯影響。
　　 結(jié)論：

21、　　 1.地錢素C促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G分泌sFlt-1，不影響人單核細(xì)胞系THP1分泌sFlt-1。
　　 2.地錢素C抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)細(xì)系T98G誘導(dǎo)的血管生成，不影響人單核細(xì)胞系THP1誘導(dǎo)的血管生成。
　　 3.sFlt-1介導(dǎo)地錢素C對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)細(xì)系T98G誘導(dǎo)的血管生成的抑制作用。
　　 4.地錢素C抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)細(xì)系T98G中MMP-7的轉(zhuǎn)錄，與ERK1/2信號(hào)通路相關(guān)。
　　

22、第二部分:褐藻多糖對(duì)膠質(zhì)瘤微環(huán)境中血管生成的影響及機(jī)制研究
　　 研究目的：
　　 1.研究褐藻多糖對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sFlt-1的影響。
　　 2.研究褐藻多糖對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的血管生成的影響。
　　 3.研究sFlt-1在褐藻多糖影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的血管生成過程中的作用。
　　 4.研究褐藻多糖影響人

23、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sFlt-1的相關(guān)機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.褐藻多糖對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sFlt-1的影響。
　　 取生長(zhǎng)良好的T98G和THP1細(xì)胞以每孔105個(gè)細(xì)胞加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，12h后加入不同濃度的褐藻多糖（終濃度分別為10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)6h，12h，24h。刺激結(jié)束后收集條件刺激上清行ELIS

24、A檢測(cè)sFlt-1的表達(dá)水平。
　　 2.褐藻多糖對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的血管生成的影響。
　　 T98G細(xì)胞和THP1細(xì)胞經(jīng)褐藻多糖(100μg/ml)刺激24h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行HUVEC成管功能試驗(yàn)。96孔板每孔鋪基質(zhì)膠70μl，每孔加入等量細(xì)胞懸液和條件上清的混合液200μl，每孔細(xì)胞數(shù)105個(gè)，6h后顯微鏡下拍照記錄。取每孔三個(gè)視野內(nèi)分散的內(nèi)皮細(xì)胞形成的管狀結(jié)構(gòu)間分叉點(diǎn)的數(shù)目的平均值

25、對(duì)成管能力進(jìn)行定量計(jì)算。
　　 3.sFlt-1在褐藻多糖影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的血管生成過程中的作用。
　　 T98G細(xì)胞和THP1細(xì)胞經(jīng)褐藻多糖(100μg/ml)刺激24h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行HUVEC成管功能試驗(yàn)。設(shè)對(duì)照組，藥物刺激組和抗體處理組。藥物刺激組為藥物刺激后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，對(duì)照組為未經(jīng)藥物刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入與刺激量相同的褐藻多糖，抗體處理組為在藥物刺激后的細(xì)胞培養(yǎng)上清

26、中加入2μg/ml的sFlt-1特異性阻斷抗體并室溫孵育0.5h。96孔板每孔鋪基質(zhì)膠70μl，每孔加入等量細(xì)胞懸液和條件上清的混合液200μl，每孔細(xì)胞數(shù)105個(gè)，6h后顯微鏡下拍照記錄。取每孔三個(gè)視野內(nèi)分散的內(nèi)皮細(xì)胞形成的管狀結(jié)構(gòu)間分叉點(diǎn)的數(shù)目的平均值對(duì)成管能力進(jìn)行定量計(jì)算。
　　 4.褐藻多糖影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sFlt-1的相關(guān)細(xì)胞因子和機(jī)制。
　　 1)T98G細(xì)胞和THP1細(xì)胞經(jīng)

27、褐藻多糖(100μg/ml)刺激24h后收集細(xì)胞提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄后行Real-timePCR檢測(cè)sFlt-1mRNA的表達(dá)。
　　 2)T98G細(xì)胞和THP1細(xì)胞經(jīng)褐藻多糖(100μg/ml)刺激24h后收集細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜上VEGFR1的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.褐藻多糖對(duì)人腦膠質(zhì)癌細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sFlt-1的影響。在24h作用時(shí)間下，隨著藥物濃度的增高，T98G細(xì)胞和

28、THP1細(xì)胞的sFlt-1的分泌水平均呈逐漸升高的趨勢(shì)。選擇100μg/ml的作用濃度，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，T98G細(xì)胞和THP1細(xì)胞的sFlt-1的分泌水平均呈逐漸升高的趨勢(shì)。
　　 2.褐藻多糖對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的血管生成的影響。褐藻多糖能夠明顯抑制T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞和THP1單核細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成。對(duì)成管能力的定量分析也進(jìn)一步明確了褐藻多糖對(duì)T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞和THP1單核細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成具

29、有顯著的抑制作用。
　　 3.sFlt-1在褐藻多糖影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1誘導(dǎo)的血管生成過程中的作用。
　　 與對(duì)照組相比，褐藻多糖刺激后(100μg/ml，24h)的T98G細(xì)胞條件培養(yǎng)上清和THP1單核細(xì)胞條件培養(yǎng)液上清明顯抑制了HUVEC的成管能力，經(jīng)sFlt-1特異性抗體的免疫性清除后其成管能力有顯著的恢復(fù)，達(dá)到與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?。?duì)成管能力的定量分析進(jìn)一步明確了這一作用。
　　

30、4.褐藻多糖影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G和人單核細(xì)胞THP1分泌sFlt-1的相關(guān)機(jī)制。
　　 1)褐藻多糖刺激后的T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞的sFlt-1mRNA水平顯著升高，THP1單核細(xì)胞的sFlt-1mRNA水平無明顯變化。
　　 2)VEGFR1在T98G細(xì)胞膜表達(dá)量極少，褐藻多糖對(duì)此無影響。褐藻多糖顯著降低了THP1細(xì)胞膜上VEGFR1的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.褐藻多糖促進(jìn)入腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98