骨髓基質(zhì)細(xì)胞側(cè)腦室移植對(duì)帕金森病模型大鼠行為和認(rèn)知功能的影響.pdf

1、目的：帕金森?。╬arkinson’s disease，PD）是一種多發(fā)于中老年人的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特點(diǎn)是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死和紋狀體區(qū)多巴胺（dopamine，DA）水平減少。臨床上以進(jìn)行性加重的運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、靜止性震顫、姿勢(shì)步態(tài)異常等為特征。近年來(lái)研究表明帕金森病患者不僅有運(yùn)動(dòng)障礙，而且有逐漸進(jìn)展的認(rèn)知功能下降，并伴有一定的焦慮、抑郁情緒，嚴(yán)重者出現(xiàn)癡呆，稱為帕金森病癡呆（Parkinson’s dis

2、ease with dementia，PDD），嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。傳統(tǒng)的藥物治療和外科手術(shù)方法只能部分改善癥狀，長(zhǎng)期療效并不樂(lè)觀，而細(xì)胞移植已成為目前研究的熱點(diǎn)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs）取材方便，來(lái)源充足，可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增，并可進(jìn)行自體移植，避免了異體間移植可能引起的免疫排斥和倫理道德上的爭(zhēng)議，這些優(yōu)點(diǎn)均使其成為理想的種子細(xì)胞。腦內(nèi)注射6-羥基多巴胺（6-hydroxyd

3、opamine，6-OHDA）制作PD模型常用于研究PD的運(yùn)動(dòng)功能障礙及療效的觀察，近年來(lái)人們開(kāi)始關(guān)注其認(rèn)知功能障礙。而目前研究多將BMSCs立體定向移植到6-OHDA所致PD模型大鼠的紋狀體，可有效改善大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，但尚未見(jiàn)有側(cè)腦室移植BMSCs治療PD模型的報(bào)道。本研究將6-OHDA注射于單側(cè)黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)制成PD模型，對(duì)PD模型運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知兩方面的改變進(jìn)行觀察，并將同種異體來(lái)源的BMSCs在體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，立體定向移植到6

4、-OHDA所致PD大鼠的側(cè)腦室，觀察側(cè)腦室移植BMSCs對(duì)PD大鼠的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能的影響。
　　 方法：
　　 ①動(dòng)物：封閉群清潔級(jí)健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 ②實(shí)驗(yàn)方法：正常成年SD大鼠60只，腹腔注射阿樸嗎啡（apomorphine，APO）淘汰有旋轉(zhuǎn)行為的大鼠1只，Morris水迷宮淘汰有記憶障礙的大鼠2只

5、后，隨機(jī)取8只大鼠歸入正常組，其余大鼠用水合氯醛麻醉，利用立體定向儀單側(cè)黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)注射6-OHDA制作右側(cè)PD模型，手術(shù)后3周腹腔注射APO誘導(dǎo)其旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于7r/min的視作制模成功。將成功的34只PD模型大鼠隨機(jī)分為BMSC組16只、PBS組10只、模型組8只。選取BMSC組大鼠右側(cè)側(cè)腦室（坐標(biāo)：前囟后1.5mm，矢狀縫右側(cè)1.0mm，硬膜下3.8mm）為注射點(diǎn)，注入經(jīng)Brd-U標(biāo)記的BMSCs懸液10μl（約1.

6、0×106個(gè)細(xì)胞），PBS組同法于大鼠右側(cè)側(cè)腦室注入等量磷酸緩沖液（PBS），模型組和正常組不作任何處理。
　　 ③實(shí)驗(yàn)評(píng)估：細(xì)胞移植后連續(xù)8周觀察APO誘導(dǎo)的PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為的變化；制模前、制模成功后（即細(xì)胞移植前）、細(xì)胞移植后第4周、細(xì)胞移植后第8周分別進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，對(duì)各組大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。側(cè)腦室移植后第1、3、7天及移植后8周各取兩只BMSC組大鼠，對(duì)腦側(cè)腦室區(qū)連續(xù)冠狀石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)

7、BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。細(xì)胞移植后8周，取各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)連續(xù)冠狀石蠟切片免疫組化染色檢測(cè)酪氨酸羥化酶（tvrosinehvdroxvlase.TH）陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 結(jié)果：
　　 ①PD大鼠運(yùn)動(dòng)功能改變：與移植前比較，細(xì)胞移植后第1-8周腹腔注射APO誘導(dǎo)BMSC組PD大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)明顯減少，轉(zhuǎn)數(shù)從移植前的（13.5±4.9）r/min降到移植后第8周的（8.7±3.8）r/min，移植前后的數(shù)據(jù)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<

8、0.05）；PBS組和模型組移植前旋轉(zhuǎn)次數(shù)分別為（15.1±3.9）r/min、（17.8±3.4）r/min，移植后第8周分別為（18.1±4.0）r/min、（19.7±4.8）r/min，移植前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與PBS組和模型組比較，APO誘導(dǎo)BMSC組PD大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)從第1周開(kāi)始就有明顯減少（P<0.05），從第3周即有顯著減少（P<0.01）；PBS組和模型組各時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

9、
　　 ②認(rèn)知功能改變：制作模型前，BMSC組、PBS組、模型組、正常組四組大鼠的尋臺(tái)潛伏期、在原平臺(tái)所在象限所占時(shí)間百分比、路程百分比、穿越平臺(tái)次數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。制模成功后即細(xì)胞移植前，與正常組相比，BMSC組、PBS組、模型組三組大鼠的尋臺(tái)潛伏期均顯著延長(zhǎng)（P<0.05），在原平臺(tái)所在象限所占時(shí)間百分比、路程百分比、穿越平臺(tái)次數(shù)均顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而B(niǎo)M.SC組、PBS組、模型組三

10、組之間無(wú)差異（P>0.05）。細(xì)胞移植后第4周和細(xì)胞移植后第8周，BMSC組的尋臺(tái)潛伏期與PBS組、模型組相比顯著縮短（P<0.05），在原平臺(tái)所在象限所占時(shí)間百分比、路程百分比、穿越平臺(tái)次數(shù)均顯著增加（P<0.05），與正常組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；PBS組、模型組與正常組相比，尋臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.05），在原平臺(tái)所在象限所占時(shí)間百分比、路程百分比、穿越平臺(tái)次數(shù)均顯著減少（P<0.05）；而模型組與PBS組相比

11、，上述指標(biāo)均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　 ③免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：BMSC組在側(cè)腦室移植BMSC后第1天可見(jiàn)側(cè)腦室壁與脈絡(luò)叢存在大量BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，移植后第3天可見(jiàn)細(xì)胞沿胼胝體有少量遷移，移植后第7天依然可見(jiàn)脈絡(luò)叢中散在的陽(yáng)性BrdU細(xì)胞，并且在胼胝體、腦室外側(cè)的周圍腦實(shí)質(zhì)均可見(jiàn)散在的陽(yáng)性細(xì)胞，而在移植后8周時(shí)未見(jiàn)有明顯陽(yáng)性細(xì)胞。移植后第8周BMSC組、PBS組、模型組的6-OHDA注射側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH陽(yáng)性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維

12、表達(dá)基本缺失。
　　 結(jié)論：
　　 ①BMSC組移植后APO誘導(dǎo)的PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為從第1周即有明顯改善，并且可以持續(xù)至少8周。
　　 ②單側(cè)黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)注射6-OHDA制成的PD模型大鼠有明顯的認(rèn)知障礙，主要表現(xiàn)在空間參考和空間工作記憶的下降。
　　 ③側(cè)腦室移植BMSCs可明顯改善6-OHDA所致PD大鼠的認(rèn)知功能障礙。
　　 ④BMSCs側(cè)腦室移植可存活并遷移至胼胝體和腦室外周的腦組