阻斷W-β-catenin信號(hào)通路對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用.pdf

1、背景和目的：
　　 各種不同病因的慢性腎臟病的發(fā)展最終均以漸進(jìn)性的腎小管間質(zhì)纖維化和腎功能衰竭為基本特征，腎小管間質(zhì)纖維化為其最后的共同病理學(xué)改變，表現(xiàn)為腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增生及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。研究證明，腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)在腎小管間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮重要的作用，EMT是指在腎小管上皮細(xì)胞在病理因素的刺激下，失去上皮細(xì)胞的特征，表現(xiàn)為肌

2、成纖維細(xì)胞特性。
　　 Wnt信號(hào)通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路，在細(xì)胞的黏附、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)、分化、凋亡以及在胚胎發(fā)育、器官發(fā)生和維持組織器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等過程中具有重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白在腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型中表達(dá)升高，但Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用機(jī)制仍不清楚。
　　 本研究體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞(human proxi

3、mal tubular epithelial cells，HKCs)，采用Wnt阻滯劑Dickkopf-1(Dkk-1)及構(gòu)建的β-catenin短發(fā)卡干擾RNA(shorthairpin RNA，shRNA)從兩個(gè)水平上阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，觀察其對(duì)腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響，探討其在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為抗腎小管間質(zhì)纖維化治療尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.將體

4、外培養(yǎng)的HKC細(xì)胞分為對(duì)照組、TGF-β1組(TGF-β1終濃度為20ng/ml)和TGF-β1+Dkk-1組(TGF-β1、Dkk-1終濃度分別為20ng/ml、100ng/ml)，培養(yǎng)48小時(shí)后RT-PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞Wnt4、β-catenin、E-cadherin和α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光染色觀察E-cadherin和α-SMA的表達(dá)。
　　 2.根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)針對(duì)

5、β-catenin基因的3個(gè)干擾靶點(diǎn)，合成序列片段，構(gòu)建β-catenin-shRNA干擾質(zhì)粒，經(jīng)鑒定片段成功插入后，以LipofectamineTM2000將空白質(zhì)粒、重組的三個(gè)干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TGF-β1(終濃度為20ng/ml)誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞，48小時(shí)后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR及Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞β-catenin的mRNA及蛋白表達(dá)，挑選對(duì)β-catenin基因抑制效果最好的β-catenin-shRNA干擾質(zhì)

6、粒。
　　 3.將HKC細(xì)胞分4組：①對(duì)照組，含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；②TGF-β1組，在常規(guī)培養(yǎng)基中加入TGF-β1(濃度為20ng/ml)；③TGF-β1+轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組，在常規(guī)培養(yǎng)基中加入TGF-β1(濃度為20ng/ml)，該組轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒；④TGF-β1+轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組，在常規(guī)培養(yǎng)基中加入TGF-β1(濃度為20ng/ml)，該組轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒；各組細(xì)胞按照分組處理或以LipofectamineT

7、M2000轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒，培養(yǎng)48h后在倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，RT-PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞β-catenin、E-cadherin和α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光染色觀察E-cadherin和α-SMA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.Wnt阻滯劑Dickkopf-1(Dkk-1)對(duì)HKC細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用
　　 Wnt4在對(duì)照組幾乎沒有表達(dá)，在TGF-β1組和TGF-β1+Dk

8、k-1組顯著上調(diào)；β-catenin的mRNA在對(duì)照組、TGF-β1組和TGF-β1+Dkk-1組均有較高的表達(dá)，組間沒有明顯差異，β-catenin的蛋白在對(duì)照組低水平表達(dá)，在TGF-β1組明顯上調(diào)，在TGF-β1+Dkk-1組表達(dá)顯著下調(diào)；E-cadherin的在對(duì)照組高表達(dá)，在TGF-β1組表達(dá)顯著降低，在TGF-β1+Dkk-1組表達(dá)明顯上調(diào)；α-SMA的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)相反，在對(duì)照組表達(dá)很低，在TGF-β1組表

9、達(dá)顯著上調(diào)，在TGF-β1+Dkk-1組表達(dá)較TGF-β1組明顯下調(diào)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，E-cadherin在對(duì)照組高表達(dá)，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，在TGF-β1組表達(dá)降低綠色熒光表達(dá)減弱，在TGF-β1+Dkk-1組的表達(dá)較TGF-β1組明顯表達(dá)升高，綠色熒光較TGF-β1組增強(qiáng)；α-SMA的紅色熒光表達(dá)完全同E-cadherin相反。
　　 2.β-catenin-shRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選
　　 構(gòu)建的β-ca

10、tenin-shRNA干擾質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序鑒定證實(shí)設(shè)計(jì)片段完全插入；按照LipofectamineTM2000說明轉(zhuǎn)染的空白質(zhì)粒及干擾質(zhì)粒，通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率為60%左右，組間沒有明顯差異，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求；RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示，3個(gè)轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA干擾質(zhì)粒組β-catenin的mRNA及蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組均顯著降低，其中β-catenin-shRNA-1干擾質(zhì)粒對(duì)β-

11、catenin的抑制效果最佳。
　　 3.shRNA干擾β-catenin對(duì)HKC細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用
　　 β-catenin的mRNA在對(duì)照組、TGF-β1組及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組均高表達(dá)，組間無差異，在轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組表達(dá)顯著降低?？偟鞍爪?catenin在對(duì)照有較低水平表達(dá)，胞核無β-catenin表達(dá)，總蛋白β-catenin在TGF-β1組表達(dá)顯著升高，胞核β-catenin也有較高表達(dá)，在轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組，總蛋白β-ca

12、tenin及胞核β-catenin表達(dá)同TGF-β1組高表達(dá)，在轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組，總蛋白β-catenin表達(dá)明顯下降，胞核無β-catenin表達(dá)E-cadherin的mRNA在對(duì)照組高表達(dá)，在TGF-β1組表達(dá)顯著下降，在轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組，同TGF-β1組一致表達(dá)顯著下降，在轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組其表達(dá)顯著上升；α-SMA的mRNA在對(duì)照組幾乎沒有表達(dá)，在TGF-β1組表達(dá)明顯升高，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組α-SMA的mRNA表達(dá)同TGF-β1組一致表達(dá)

13、明顯升高，在轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組，α-SMA的mRNA顯著下降。細(xì)胞免疫熒光顯示，E-cadherin在對(duì)照組為明亮的綠色熒光，在TGF-β1組綠色熒光表達(dá)減弱，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組表達(dá)同TGF-β1組，綠色熒光表達(dá)減弱，在轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組，綠色熒光較TGF-β1組及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組顯著增強(qiáng)；α-SMA的紅色熒光表達(dá)完全同E-cadherin相反。
　　 結(jié)論：
　　 1.Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與HKC細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，Wnt阻