TAT介導(dǎo)EGFP在小鼠體內(nèi)的分布及介導(dǎo)BDNF治療PD模型鼠的實驗研究.pdf

1、鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文TAT介導(dǎo)EGFP在小鼠體內(nèi)的分布及介導(dǎo)BDNF治療PD模型鼠的實驗研究姓名：王海珍申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：張云漢許予明200705012007屆博士研究生畢業(yè)論文TAT介導(dǎo)EGFP在小鼠體內(nèi)的分布及介導(dǎo)BDNF治療PD模型鼠的試驗研究導(dǎo)到組織及細胞內(nèi)，甚至透過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。國外已有學(xué)者將TAT與相對分子質(zhì)量為(15～200)X103的蛋白進行融合后，介導(dǎo)這些蛋白從細胞外到細胞

2、內(nèi)的直接跨膜轉(zhuǎn)運。還有報道提到TAT與銅鋅超氧化物歧化酶的融合蛋白跨膜進入胰島B細胞可以達到治療I型糖尿病的目的。將TAT與P53和P27等腫瘤抑制蛋白輸入含有腹膜腫瘤的小鼠模型，可以延長小鼠的壽命。TAT的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用具有速度快，不依賴于溫度、能量、細胞膜抗體，而且對細胞沒有損傷等特點，因此被認為是一種很有前途的運載工具；目前有關(guān)TAT融合蛋白的神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)用多集中在對腦缺血疾病的研究中，對于TAT融合腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子治療帕金森病的研究，

3、國內(nèi)外尚未見報道。本課題首先利用增強綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentproteinEGFP)作為標記蛋白，構(gòu)建TAT—EGFP重組載體并表達融和蛋白，靜脈注射小鼠后觀察融和蛋白進入體內(nèi)各組織的情況，以證實TAT的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，尤其是穿透血腦屏障進入腦組織的能力，為TAT攜帶藥物治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論基礎(chǔ)。隨后構(gòu)建TAT—BDNF重組載體并表達融和蛋白，經(jīng)過在體外與多巴胺能神經(jīng)元作用檢測其生物學(xué)活性后，

4、靜脈注入PD大鼠模型，來觀察TAT—BDNF對模型鼠的治療作用，以期找到一種能靜脈應(yīng)用且能夠穿透血腦屏障有效治療PD的方法。本研究分為以下三個部分：第一部分TAT介導(dǎo)EGFP在小鼠體內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運方法：1以pEGFPN3為模版，通過PCR及基因克隆技術(shù)，構(gòu)建表達載體pEGFP。2人工合成編碼TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的兩條DNA片段，退火后得到雙鏈。雙鏈經(jīng)過酶切及與pEGFP連接后，構(gòu)建表達載體p1AT—EGFP。利用雙酶切及基因測序來鑒定載體。3