RAD001對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤的抗腫瘤作用研究.pdf

1、1.研究背景 目前非霍奇金淋巴瘤發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)。在美國(guó)，T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病率約占所有非霍奇金淋巴瘤發(fā)病率的15.20％。而在中國(guó)，T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病率偏高，約占25-35％。與B細(xì)胞淋巴瘤相比，多數(shù)T細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后較差，目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)治療，若按常規(guī)CHOP方案治療效果欠佳，且容易復(fù)發(fā)，因此如何提高T細(xì)胞淋巴瘤治療的有效率和總生存成為當(dāng)前淋巴瘤治療中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。 隨著人們對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及與之相關(guān)的分子靶點(diǎn)藥物研究的不斷

2、深入，靶向治療己成為一種極有發(fā)展前景的腫瘤治療模式。mTOR對(duì)細(xì)胞正常生長(zhǎng)增殖中起著極為重要的作用。許多腫瘤存在有編碼mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的基因突變，這些蛋白的表達(dá)異常可引起mTOR通路過(guò)度激活。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞由于存在P13K/AKT/mTOR途徑失調(diào)，對(duì)mTOR抑制劑更為敏感。以mTOR為靶點(diǎn)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性藥物的抗藥性。 RAD001是新型口服的mTOR抑制劑，具有更

3、好的水溶性以及在有機(jī)溶劑和水溶液中有更好的穩(wěn)定性。多項(xiàng)臨床前研究表明，RAD001單藥對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤活性；Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果提示RAD001單藥不良反應(yīng)輕，易為患者所接受。多項(xiàng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示了RAD001有良好的臨床應(yīng)用前景。 關(guān)于靶向治療如何與化療藥物聯(lián)合或靶向藥物彼此之間的聯(lián)合也是靶向治療的一個(gè)備受關(guān)注的問(wèn)題。一些臨床前研究和臨床試驗(yàn)已初步顯示由于各種藥物不同的作用機(jī)制以及藥物間的相互作用，通過(guò)改變藥物的聯(lián)

4、合用藥方式可能改變藥物間原來(lái)的拮抗作用，轉(zhuǎn)化為協(xié)同或相加作用。遺憾的是，到目前為止，RAD001治療T細(xì)胞淋巴瘤的研究資料仍非常缺乏。因此，研究RAD001對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤抗腫瘤作用以及與其它藥物不同聯(lián)合方式的抗增殖作用，有可能為T(mén)細(xì)胞淋巴瘤的治療提供新選擇。 2.研究方法 將RAD001單藥以及其分別與化療藥物ADM、VP-16、VCR和靶向藥物Velcade、Gleevec聯(lián)合作用于人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat

5、細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)RAD001單藥及聯(lián)合用藥對(duì)Hut-78、Jurkat細(xì)胞抗增殖作用；然后用流式細(xì)胞學(xué)(PI染色)檢測(cè)RAD001單藥對(duì)Hut-78、Jurkat細(xì)胞凋亡/周期阻滯的影響；最后提取實(shí)驗(yàn)組(用RAD001單藥處理)和對(duì)照組(空白對(duì)照組和溶劑DMSO組)細(xì)胞總蛋白，通過(guò)Western Blotting分析目的蛋白p70s6k、p-p70s6k、cyclinD1、cyclinD3、cdk4在不同組間表達(dá)是否有差異。

6、 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1 RAD001單藥對(duì)人T淋巴瘤細(xì)胞株抗腫瘤作用RAD001單藥作用于人T細(xì)胞淋巴瘤Hut-78、Jurkat細(xì)胞48小時(shí)后，測(cè)得IC50值分別為(5.57±0.08)μmol/L、(4.52±0.05)μmol/L，提示RAD001單藥對(duì)Hut-78、Jurkat細(xì)胞均有抗增殖活性，呈濃度依賴性。 3.2 RAD001與化療藥物聯(lián)合對(duì)人T淋巴瘤細(xì)胞抗腫瘤作用RAD001單藥分別與化療藥物ADM、VP

7、-16、VCR．以不同濃度梯度按一定比例混合共同作用于Hut-78、Jurkat細(xì)胞，結(jié)果顯示：在一定濃度范圍內(nèi)，RAD001分別與ADM、VP-16聯(lián)合作用指數(shù)CI值均＜1，提示有RAD001與ADM、VP-16均有協(xié)同作用；而RAD001和VCR聯(lián)合作用指數(shù)CI值＞1，提示RAD001與VCR聯(lián)合時(shí)有拮抗作用，而且在Jurkat細(xì)胞中表現(xiàn)更為明顯。 3.3 RAD001與靶向藥物聯(lián)合作用對(duì)人T淋巴瘤細(xì)胞抗腫瘤作用RAD001

8、單藥分別與靶向藥物Velcade、Gleevec以不同濃度梯度按一定比例混合共同作用于Hut-78、Jurkat細(xì)胞，結(jié)果顯示：在一定濃度范圍內(nèi)，RAD001和Velcade聯(lián)合作用CI值均＜1，提示有RAD001與Velcade有協(xié)同作用，隨兩藥濃度的增加，協(xié)同作用愈為顯著；而RAD001和Gleevec聯(lián)合作用指數(shù)CI＞1，提示RAD001與Gleevec聯(lián)合時(shí)有拮抗作用。 3.4研究RAD001對(duì)人T淋巴瘤細(xì)胞凋亡/周期阻

9、滯的影響RAD001作用于Hut-78、Jurkat細(xì)胞24小時(shí)后并未見(jiàn)明顯凋亡，延長(zhǎng)RAD001作用時(shí)間至48小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞仍未見(jiàn)明顯凋亡，實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組、DMSO組的細(xì)胞凋亡率均無(wú)明顯差異(P＜0.05)。而當(dāng)RAD001作用于實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞24小時(shí)后，與對(duì)照組(空白對(duì)照組和DMSO對(duì)照組)相比，G1期細(xì)胞比例明顯增多；延長(zhǎng)RAD001作用時(shí)間至48小時(shí)后，G1期細(xì)胞的比例較24小時(shí)實(shí)驗(yàn)組也有明顯提高，這種G1期阻滯現(xiàn)象在Jurk

10、at細(xì)胞中表現(xiàn)得更為明顯。提示了RAD001對(duì)人T細(xì)胞淋巴瘤的抗增殖作用可能不是在于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而是通過(guò)把腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而其周期阻滯作用呈時(shí)間依賴性。 3.5進(jìn)一步探討RAD001對(duì)人T淋巴瘤細(xì)胞抗增殖作用的分子機(jī)制 ①RAD001作用48小時(shí)后與對(duì)照組蛋白表達(dá)情況比較，發(fā)現(xiàn)Hut-78、Jurkat細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組cyclinD1、cyclinD3、cdk4表達(dá)均明顯減少或沒(méi)有表達(dá)，提示RAD00

11、1對(duì)人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞G1期相關(guān)周期蛋白有明顯抑制作用，從而是把腫瘤細(xì)胞阻滯在G1期。 ②當(dāng)RAD001作用于Hut-78、Jurkat細(xì)胞48小時(shí)后，與對(duì)照組蛋白表達(dá)情況相比，發(fā)現(xiàn)p70s6k、p-p70s6k在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)明顯受到抑制，提示當(dāng)RAD001作用于人T淋巴瘤細(xì)胞時(shí)，通過(guò)阻斷靶點(diǎn)mTOR，使P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路的下游受到抑制，影響腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)節(jié)和代謝等，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，從而發(fā)揮其抗增殖作用

12、。 3.6 RAD001聯(lián)合ADM或Velcade不同用藥順序?qū)ut-78細(xì)胞抗增殖作用的影響 ①通過(guò)變換RAD001和ADM、RAD001和Velcade的用藥順序，結(jié)果提示先用RAD001后再用ADM或Velcade，兩者存在拮抗作用，原因可能在于ADM及Velcade都是G2/M期阻滯的藥物，會(huì)把腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，若先用RAD001會(huì)使Hut-78細(xì)胞阻滯在G1期，而再用ADM或Velcade就不能使腫瘤

13、細(xì)胞進(jìn)入G2/M期。 ②為了進(jìn)一步探討先用RAD001后用ADM或Velcade之間的拮抗作用，我們把RAD001先作用于Hut-78細(xì)胞，24h后更換培養(yǎng)基去除其中的RAD001，然后再加入ADM或Velcade作用24h，結(jié)果表明去除培養(yǎng)基中的RAD001后ADM或Velcade就可以使G1期的細(xì)胞進(jìn)入G2期。 4.結(jié)論 1)RAD001單藥對(duì)人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat細(xì)胞均有良好抗增殖作用；

14、 2)RAD001與化療藥物ADM、VP-16聯(lián)合作用于人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat細(xì)胞均提示有協(xié)同作用，而RAD001與VCR聯(lián)合作用于Hut-78細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞具有拮抗作用； 3)RAD001與靶向藥物Velcade聯(lián)合作用于人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat細(xì)胞均提示有協(xié)同作用，而RAD001與Gleevec聯(lián)合作用于Hut-78、Jurkat細(xì)胞具有拮抗作用； 4)RAD001對(duì)人T淋巴瘤Hu

15、t-78、Jurkat細(xì)胞的抗增殖作用可能是通過(guò)把腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，而未發(fā)現(xiàn)RAD001對(duì)Hut-78、Jurkat細(xì)胞有誘導(dǎo)作用； 5)RAD001對(duì)人T淋巴瘤Hut-78、Jurkat細(xì)胞抗增殖作用的分子機(jī)制可能是通過(guò)阻斷mTOR靶蛋白下調(diào)了P13K/Akt/mTOR下游通路和抑制了G1期周期相關(guān)蛋白cycliD1、cyclinD3和cdk4等，從而抑制了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。 6)RAD001和ADM或Velcade聯(lián)

16、用時(shí)，不同用藥順序?qū)ut-78細(xì)胞抗增殖活性不同。 ①先用RAD001后用ADM，在周期阻滯方面兩者會(huì)產(chǎn)生拮抗作用，而當(dāng)去除了培養(yǎng)基中的RAD001后，RAD001對(duì)ADM周期阻滯的拮抗作用消除。 ②先用RAD001后用Velcade，在周期阻滯方面兩者會(huì)產(chǎn)生拮抗作用，而當(dāng)去除了培養(yǎng)基中的RAD001后，RAD001對(duì)Velcade周期阻滯的拮抗作用消除。 ③目前RAD001在臨床試驗(yàn)中的推薦用法是連續(xù)每天口服