高原低氧低溫復(fù)合作用對(duì)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及其防治作用的研究.pdf

1、研究目的：
　　我國(guó)高原山地面積分布廣泛，3000米以上的高海拔地區(qū)占陸地面積的1/6，且大多處于我國(guó)邊境地區(qū)，戰(zhàn)略意義十分重要。低氧、低溫是影響高原地區(qū)人體健康和作業(yè)能力的主要環(huán)境因素。血管內(nèi)皮細(xì)胞是機(jī)體低氧、低溫暴露過(guò)程中最易受損傷的部位；內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂能夠直接影響高原特發(fā)性疾病的發(fā)生發(fā)展；逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂可成為防治高原環(huán)境因素?fù)p傷疾病的重要策略。因此，研究高原低氧、低溫及復(fù)合條件對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其機(jī)制，探討內(nèi)皮細(xì)

2、胞保護(hù)藥物具有重要的實(shí)用價(jià)值。本研究通過(guò)建立模擬高原低氧低溫復(fù)合損傷的整體動(dòng)物模型和內(nèi)皮細(xì)胞損傷的體外模型，探討高原低氧低溫復(fù)合作用對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷規(guī)律和作用機(jī)制；進(jìn)而在此基礎(chǔ)上，研究 ATP敏感性鉀通道開放劑二氮嗪防治低氧低溫所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用。本研究將為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)高原環(huán)境因素?fù)p傷和研發(fā)新的高原特發(fā)疾病防治藥物提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.模擬高原低氧、低溫及其復(fù)合環(huán)境因素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及兒茶酚胺類內(nèi)

3、分泌激素影響的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。采用高原減壓低氧和低溫復(fù)合實(shí)驗(yàn)艙模擬高原環(huán)境；南京建成NO測(cè)定試劑盒檢測(cè)NO；上海藍(lán)基ELISA試劑盒檢測(cè)ADR、NADR、ET的表達(dá)；武漢博士德ELISA試劑盒檢測(cè)VEGF的表達(dá)。
　?。?）高原低氧低溫復(fù)合作用對(duì)大鼠血管內(nèi)皮功能和兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素的影響。分別設(shè)置正常對(duì)照組（2m、25℃）、低氧低溫復(fù)合1組（3000m、10℃）、低氧低溫復(fù)合2組（6000m、10℃）、低氧低溫復(fù)合3組（6000m

4、、10℃）、低氧低溫復(fù)合4組（6000m、-5℃）。在低氧低溫復(fù)合環(huán)境下干預(yù)1小時(shí)。測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中NO、ADR含量的變化，采用單因素方差分析、多因素方差分析、析因方差分析，以確定低氧低溫復(fù)合環(huán)境下是否能夠?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物造成血管內(nèi)皮功能和ADR含量的變化，并且確定高原低氧低溫復(fù)合損傷的海拔和溫度。
　?。?）高原低氧、低溫及其復(fù)合作用對(duì)大鼠血管內(nèi)皮功能和兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素的影響。分別設(shè)置正常對(duì)照組（2m、25℃）、高原低氧組（60

5、00m、25℃）、高原低溫組（2m、-5℃）、高原低氧低溫復(fù)合組（6000m、-5℃），干預(yù)1小時(shí)。測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中NO、VEGF、ADR、NADR含量的變化，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)、單因素方差分析、多因素方差分析、析因方差分析，以確定低氧、低溫以及低氧低溫復(fù)合環(huán)境的對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血管內(nèi)皮功能和兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素的影響。此外，分別設(shè)置對(duì)照組、高原低氧低溫復(fù)合組1h組（6000m、-5℃、1h）、高原低氧低溫復(fù)合組4h組（6000m、-5℃、

6、4h）和高原低氧低溫復(fù)合組8h組（6000m、-5℃、8h）。測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中NO、ET、VEGF、ADR、NADR含量的變化，采用單因素方差分析以明確低氧低溫的作用時(shí)間對(duì)血管內(nèi)皮和兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素的影響，并綜合以上結(jié)果，進(jìn)行分析確定急性高原低氧低溫暴露復(fù)合損傷的動(dòng)物模型。
　　2.模擬高原低氧、低溫及其復(fù)合環(huán)境因素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。采用主動(dòng)脈血管片貼壁培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)雄性Wistar大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞；

7、ADR模擬低溫環(huán)境對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響；南京建成 LDH、NO、NOS測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、NO以及NOS的含量；MTT法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡；上海藍(lán)基ELISA試劑盒檢測(cè)VEGF、ET、HIF1-a的表達(dá)。
　　（1）模擬高原低氧環(huán)境對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。分別設(shè)置正常對(duì)照組（21％O2，37℃）、低氧24h組（1%O2，37℃，24h）、低氧25h組（1%O2，37℃，25h）、低氧27h組（

8、1%O2，37℃，27h）。
　　（2）腎上腺素（ADR）模擬低溫環(huán)境以及復(fù)合低氧環(huán)境對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響時(shí)，分別設(shè)置正常對(duì)照組、ADR1組（ADR終濃度為0.1mmol/L）、ADR2組（ADR終濃度為0.01mmol/L）、ADR3組（ADR終濃度為0.001mmol/L）。
　?。?）模擬高原低氧低溫復(fù)合環(huán)境因素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響。分別設(shè)置正常對(duì)照組、低氧組（1%O2、92%N2、5%CO2、37℃、27h）、ADR組（AD

9、R終濃度為0.1mmol/L常氧環(huán)境培養(yǎng)）、低氧ADR組（ADR終濃度為0.1mmol/L、1%O2、92%N2、5%CO2、37℃、27h）。采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)、單因素方差分析，闡明低氧低溫復(fù)合損傷與單一因素的損傷特點(diǎn)，明確低氧低溫復(fù)合作用內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用規(guī)律，并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　3.二氮嗪對(duì)模擬高原低氧、低溫及其復(fù)合環(huán)境因素血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的防治作用。
　?。?）二氮嗪對(duì)低氧致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的防治作用。分別設(shè)置正常對(duì)照

10、組、低氧+二氮嗪組（二氮嗪終濃度為0.1mmol/L的無(wú)血清M199培養(yǎng)基與內(nèi)皮細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱中低氧暴露27h）、低氧+二氮嗪+5-HD組（二氮嗪和5-HD終濃度為0.1mmol/L的無(wú)血清 M199培養(yǎng)基與內(nèi)皮細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱中低氧暴露27h）。
　?。?）二氮嗪對(duì)低氧低溫復(fù)合因素致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的防治作用。分別設(shè)置正常對(duì)照組、低氧ADR+二氮嗪組（ADR和二氮嗪終濃度為0.1mmol/L的無(wú)血清M199培養(yǎng)基與內(nèi)皮細(xì)胞置于

11、低氧培養(yǎng)箱中低氧暴露27h）、低氧+ADR+二氮嗪+5-HD組（ADR、二氮嗪、5-HD終濃度為0.1mmol/L的無(wú)血清M199培養(yǎng)基與內(nèi)皮細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱中低氧暴露27h）。采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)、單因素方差分析，探明二氮嗪對(duì)低氧及低氧低溫復(fù)合因素致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.高原低氧低溫復(fù)合作用對(duì)大鼠血管內(nèi)皮功能和兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素的影響。
　　（1）分別在海拔3000m、6000m時(shí)觀察不

12、同溫度（10℃、-5℃）對(duì)大鼠血清NO、ADR影響。與對(duì)照組相比，海拔3000m、10℃環(huán)境暴露下，血清NO呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異；海拔3000m、-5℃環(huán)境可引起血清NO含量的顯著下降（P<0.05）。與對(duì)照組相比，海拔3000m、10℃和3000m、-5℃環(huán)境暴露下大鼠血清ADR含量顯著升高（P<0.01）。在海拔6000m、10℃的環(huán)境下大鼠血清NO、ADR含量沒(méi)有顯著變化。與對(duì)照組相比，海拔6000m、-5℃環(huán)境下大

13、鼠血清 NO的釋放量顯著降低（P<0.01），ADR的釋放量顯著升高（P<0.01）。多因素方差分析結(jié)果顯示，海拔高度和溫度的交互作用對(duì)ADR的產(chǎn)生了顯著的影響（P<0.05）。
　?。?）高原低氧、低溫以及其復(fù)合作用對(duì)大鼠血管內(nèi)皮功能和兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素的影響。分別觀察海拔6000m和低溫-5℃及其復(fù)合作用對(duì)大鼠血清NO、VEGF、ADR、NADR影響。與對(duì)照組相比，高海拔低氧組（6000m、25℃、1h）大鼠血清NO的含量顯

14、著降低（P<0.05），VEGF的釋放量顯著升高（P<0.05），ADR、NADR的釋放量有所升高，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異。與對(duì)照組相比，低溫組（0m、-5℃、1h）大鼠 NO的釋放量有所降低，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異；VEGF的釋放量顯著升高（P<0.01），ADR、NADR的釋放量顯著升高（P<0.01）。與對(duì)照組相比，低氧低溫（6000m、-5℃、1h）復(fù)合環(huán)境下NO的含量顯著下降（P<0.01）；VEGF、ADR、NADR表達(dá)顯著增高

15、（P<0.01）。海拔高度對(duì) NO、VEGF、ADR都具有顯著影響（P<0.05），溫度對(duì) ADR、NADR具有顯著影響（P<0.05），海拔高度和溫度的交互作用對(duì)NO、NADR沒(méi)有顯著影響（P<0.05），但是對(duì)VEGF、ADR的產(chǎn)生了顯著的影響（P<0.05）。
　?。?）高原低氧、低溫以及其復(fù)合作用對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素影響的時(shí)間特點(diǎn)的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低氧低溫復(fù)合干預(yù)1h、4h組，大鼠NO的釋放量顯

16、著降低（P<0.01）。VEGF的含量在1h組（P<0.01）、4h組（P<0.05）顯著升高，8h組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異。4h組ET的含量顯著升高（P<0.05），1h組和8h組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異。1h、4h組ADR、NADR的釋放顯著升高（P<0.01）。
　　2.體外模擬低氧低溫環(huán)境對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用
　?。?）采用主動(dòng)脈血管片貼壁的方法，培養(yǎng)出大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性率96%以

17、上。
　　（2）1%O2的低氧環(huán)境下27h可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞LDH含量增加（P<0.01），細(xì)胞存活率、NO、NOS含量顯著下降（P<0.01），VEGF、ET、HIF1a表達(dá)增高（P<0.01），細(xì)胞凋亡增加。
　?。?） ADR濃度為0.1mmol/L可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞LDH含量增加（P<0.01），細(xì)胞存活率顯著下降（P<0.01），VEGF、ET、HIF1a表達(dá)增高（P<0.01），細(xì)胞凋亡增加。
　?。?）A

18、DR濃度為0.1mmol/L干預(yù)的內(nèi)皮細(xì)胞在低氧（1%O2）環(huán)境中培養(yǎng)27h，發(fā)現(xiàn)LDH含量增加（P<0.01），細(xì)胞存活率下降（P<0.01），NO含量下降（P<0.01），NOS含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，VEGF、ET、HIF1a表達(dá)增高（P<0.01），細(xì)胞凋亡增加（P<0.01）。
　　3.二氮嗪對(duì)低氧以及低氧低溫復(fù)合作用致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的防治作用
　?。?）終濃度為0.1mmol/L的二氮嗪干預(yù)的內(nèi)皮細(xì)胞在1%O2的低氧

19、環(huán)境中培養(yǎng)27h，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異；與低氧組相比 LDH含量顯著下降（P<0.01），細(xì)胞存活率顯著增高（P<0.01），NO、NOS釋放量顯著上升（P<0.01），VEGF、ET的表達(dá)下降（P<0.01），并且細(xì)胞凋亡也顯著降低（P<0.01）。
　?。?）終濃度為0.1mmol/L的二氮嗪和ADR干預(yù)的內(nèi)皮細(xì)胞在1%O2的低氧環(huán)境中培養(yǎng)27h，與低氧組相比LDH含量顯著下降（P<0.01），細(xì)胞存活率顯著增高（

20、P<0.01），VEGF、ET的表達(dá)下降（P<0.01），并且細(xì)胞凋亡也顯著降低（P<0.01）；NO、NOS的釋放量顯著降低（P<0.01），HIF1a表達(dá)增高（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.模擬高原低氧低溫復(fù)合環(huán)境因素急性暴露可導(dǎo)致兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素的含量增加，大鼠血管內(nèi)皮功能損傷。
　?。?）海拔6000米-5℃的模擬高原低氧低溫復(fù)合環(huán)境能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠血清兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素的升高，血管內(nèi)皮功能的降

21、低；與以上復(fù)合環(huán)境相比，6000米10℃的復(fù)合環(huán)境對(duì)血管內(nèi)皮功能和兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素作用減輕。結(jié)果提示，低氧低溫復(fù)合環(huán)境下兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素的升高可能是導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷的重要影響因素，與低氧交互作用能夠促使并加劇血管內(nèi)皮的嚴(yán)重?fù)p傷。
　?。?）多因素方差分析和析因方差分析結(jié)果表明，在海拔較低（3000m）、溫度較高（10℃）的環(huán)境下，海拔高度和溫度以及復(fù)合作用對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷并不顯著，但是隨著海拔的升高（6000m）和溫度的降

22、低（-5℃），海拔高度和溫度的復(fù)合作用能夠發(fā)生疊加效應(yīng)造成內(nèi)皮細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。6000米-5℃的低氧低溫復(fù)合環(huán)境能夠顯著影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)皮功能和兒茶酚胺類內(nèi)分泌激素的變化，干預(yù)4小時(shí)能夠造成大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的急性低氧低溫復(fù)合損傷。
　　2.模擬高原低氧暴露能夠?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞造成損傷；ADR模擬低溫暴露能夠?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞造成損傷；二者復(fù)合作用能夠?qū)е卵軆?nèi)皮細(xì)胞損傷。
　　3. ATP敏感性鉀通道開放劑二氮嗪能夠改善低氧處理所造