脂質(zhì)體介導(dǎo)Survivin基因過表達(dá)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.pdf

1、嬰幼兒血管瘤是嬰幼兒期最常見的良性腫瘤，是“血管形成依賴性”疾病的典型代表，發(fā)病率達(dá)10~12％，男女比例1:3~5。血管瘤由大量新生毛細(xì)血管和增殖的內(nèi)皮細(xì)胞組成，而內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡是血管形成的核心。如何能通過干預(yù)血管形成中的關(guān)鍵基因，以控制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡，是促進(jìn)或抑制血管形成的關(guān)鍵。目前關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制尚不完全明確。Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的、迄今為止最強(qiáng)的凋亡抑制因子，有研究表明及本課題前期研究發(fā)現(xiàn)sur

2、vivin、VEGF血管瘤不同時期表達(dá)有差異并相關(guān)。本研究采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將 survivin基因?qū)塍w外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，上調(diào)survivin基因表達(dá)，探討survivin基因過表達(dá)對血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，以揭示survivin基因在血管形成中的作用，為尋找促進(jìn)和抑制血管形成的新靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗依據(jù)。
　　第一部分構(gòu)建人survivin基因的真核表達(dá)載體
　　目的：構(gòu)建帶EGFP的

3、人Survivin基因真核表達(dá)載體重組質(zhì)粒pEGFP-N3/survivin。
　　方法：采用RT-PCR技術(shù)，從增生期血管瘤細(xì)胞中獲得帶有EcoRⅠ和BglⅡ酶切位點(diǎn)的目的基因 survivin，經(jīng)過 T-A克隆，與質(zhì)粒 pEGFP-N3構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N3/survivin，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測序鑒定。
　　結(jié)果：經(jīng)限制性酶切鑒定及測序分析證實(shí) pEGFP-N3/survivin目的基因序列正確。
　　

4、結(jié)論：成功構(gòu)建人survivin基因真核表達(dá)載體pEGFP-N3/survivin，可滿足本實(shí)驗的相關(guān)需要。
　　第二部分脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP-N3/survivin轉(zhuǎn)染HUVECs及對其生物學(xué)行為的影響
　　目的：通過脂質(zhì)體介導(dǎo)survivin基因轉(zhuǎn)染HUVECs后，改變其生物學(xué)行為，促進(jìn)細(xì)胞生長增殖，探討survivin基因參與血管形成的機(jī)制。
　　方法：采用脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒 pEGFP-N3/survi

5、vin轉(zhuǎn)染 HUVECs，使細(xì)胞中 survivin表達(dá)上調(diào)；RT-PCR法檢測 Survivin、VEGF的mRNA表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)及 Western-blot法檢測Survivin、VEGF的蛋白表達(dá)；MTT法及繪制細(xì)胞生長曲線觀察 HUVECs的生長增殖能力。
　　結(jié)果：1、脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP-N3/survivin成功轉(zhuǎn)染HUVECs，倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞胞漿可見綠色熒光；2、經(jīng)過免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR及W

6、estern-blot法檢測證實(shí)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的Survivin、VEGF的mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)，與正常對照組比較差異有顯著性(p<0.05)；3、MTT檢測及繪制的細(xì)胞生長曲線觀察到轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生長增殖能力增強(qiáng)。
　　結(jié)論：1、脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP-N3/survivin成功轉(zhuǎn)染HUVECs，使細(xì)胞中survivin基因過表達(dá)。2、Survivin基因過表達(dá)提高了HUVECs生長增殖能力3. Survivin基因過表達(dá)