診斷超聲聯(lián)合微泡促進MSCs歸巢缺血心肌及改善心功能的實驗研究.pdf

1、研究背景： 心肌梗死(Myocardial infarction，MI)是由于冠狀動脈循環(huán)改變引起冠狀血流和心肌需求之間不平衡而導致的心肌損害，是臨床上一種嚴重的缺血性心臟病(Ischcmicheart disease，IHD)。目前，治療冠心病的常用方法諸如藥物、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)及冠狀動脈旁路移植等雖然能改善心肌缺血，卻不能使梗死區(qū)的血管再生。新近國內(nèi)外興起的一些干細胞移植實驗治療缺血性心臟病，通過再生血管，為治療這類疾

2、病提供了新思路。 干細胞移植治療心肌梗死在大量動物實驗及臨床中的應用已取得了令人鼓舞的療效，越來越多的證據(jù)表明，骨髓來源的干細胞能夠參與血管新生，改善心肌梗死后血流灌注及心臟功能。被用于移植的細胞種類很多，其中骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)目前被公認最適合用于細胞移植治療，其易于分離提取，具有高度的擴增潛能，有良好的基因穩(wěn)定性、組織相容性好、不涉及倫理道德問題等優(yōu)點，成為研究的熱點。

3、 但干細胞移植治療心肌缺血目前還存在一些問題，包括干細胞移植途徑的有創(chuàng)性、細胞移植效率低下及干細胞的定向歸巢能力欠佳等。如何尋找一種無創(chuàng)、移植效率更高及定向能力好的移植途徑與方法呢?研究顯示，脈沖式治療超聲聯(lián)合白蛋白微泡Optison能有效將經(jīng)靜脈移植的骨髓單個核細胞靶向運送至心肌病動物模型，心肌毛細血管密度、缺血心肌的血流灌注，VCAM-1，ICAM-1等黏附分子表達均得到了顯著提高，心臟功能也得到明顯改善，表明超聲介導的微泡破

4、壞能提高干細胞的靶向歸巢能力進而更有效地實現(xiàn)干細胞移植治療心臟病的效果。 研究目的： 1.探討診斷超聲聯(lián)合微泡促進靜脈移植骨髓MSCs歸巢兔缺血心肌的可行性及其機制； 2.探討診斷超聲聯(lián)合微泡靜脈移植MSCs改善梗死后心肌血流灌注和心功能的有效性； 3.初步探討診斷超聲聯(lián)合微泡作用下無創(chuàng)移植MSCs改善心肌梗死后心功能的可能機制。 研究方法： 采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法進行兔骨髓MSC

5、s的分離、純化及培養(yǎng)，檢測其生物學特性。流式細胞儀檢測細胞表面標記分子，成脂、成骨誘導分化進行細胞鑒定。 冠狀動脈左前降支結(jié)扎法建立兔心肌梗死模型，采用血清學、影像學及病理學方法評價模型的建立。 以熒光標記物DAPI標記MSCs，移植48h觀察標記MSCs在靜脈移植MSCs組與超聲+微泡+MSCs組心肌、肺等臟器的熒光分布并進行陽性細胞計數(shù)和統(tǒng)計學比較。MSCs移植后4周透射電鏡觀察各組(PBS組、超聲+微泡組、靜脈移植

6、MSCs組與超聲+微泡+MSCs組)心肌缺血區(qū)血管超微結(jié)構(gòu)。免疫組織化學檢測心肌缺血區(qū)VCAM-1、SDF-1表達并行定量分析。 MSCs移植后4周HE染色檢測心肌缺血區(qū)的血管密度(Capillary density，CD)、免疫組織化學檢測CD34表達、western blot檢測血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)水平，心肌聲學造影(Myocardial cont

7、rast echocardiography，MCE)評價心肌血流灌注。Masson染色檢測心肌膠原纖維形成，并計算各組膠原面積。免疫組織化學檢測各組心肌梗死區(qū)Bax蛋白的表達情況。通過M型超聲與雙平面Simpson法檢測左室收縮功能。 結(jié)果： 培養(yǎng)的MSCs貼壁生長，呈梭形為主；細胞表面高表達CD44，幾乎不表達CD45，不表達CD34。成脂誘導培養(yǎng)后油紅O染色胞漿脂滴形成，成骨誘導后堿性磷酸酶染色見鈣顆粒，茜素紅S染色

8、鈣結(jié)節(jié)形成。 冠狀動脈結(jié)扎法建立MI模型后，MCE顯示左室前壁、前間隔呈灌注缺損，Masson染色左室前壁梗死區(qū)呈藍色染色。心肌梗死后兔左室收縮功能明顯降低。 熒光顯微鏡下計數(shù)并比較靜脈移植MSCs組與超聲+微泡+MSCs組心肌梗死及周圍區(qū)DAPI陽性細胞數(shù)，分別為(147±19)個，(213±27)個，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在正常供血區(qū)心肌內(nèi)未見陽性細胞。透射電鏡顯示超聲+微泡+MSCs組與超聲+微泡組心肌

9、缺血區(qū)血管一側(cè)內(nèi)皮細胞間隔增大，血管通透性增加。免疫組織化學檢測SDF-1在各組中的心肌細胞胞膜與胞漿均有棕黃色陽性表達，超聲+微泡+MSCs組的灰度(188.45±2.83)與靜脈移植MSCs組(183.94±7.29)間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高于超聲+微泡組(175.46±8.13)和PBS組(170.52±6.04)(兩者P<0.05)。超聲+微泡+MSCs組的VCAM-1陽性細胞數(shù)量(77±44)個顯著高于靜脈移植M

10、SCs組(34±18)個，超聲+微泡組(12±3)個及PBS組(8±5)個(三者P<0.01)。 HE染色檢測超聲+微泡+MSCs組平均CD為(44±23)個，高于PBS組(19±10)個、超聲+微泡組(22±5)個及MSCs組(26±7)(三者P<0.01)。Masson染色檢測心肌膠原面積分別為PBS組(16.88±5.84)％、超聲+微泡組(14.77±2.95)％、MSCs組(12.05±4.83)％和超聲+微泡+MS

11、Cs組(8.97±3.5)％，超聲+微泡+MSCs組與前三組比較，膠原面積分別縮小約25.6％、40.1％及46.8％。免疫組織化學檢測超聲+微泡+MSCs組CD34陽性血管最多，分布密集，MSCs組較豐富，超聲+微泡組次之，PBS組的陽性血管最少。Bax蛋白陽性表達在PBS組最高，超聲+微泡組次之，MSCs組進一步減少，超聲+微泡+MSCs組最少。M型超聲檢測超聲+微泡+MSCs組的FS(％)測值顯著高于PBS組和超聲+微泡組比較，P

12、<0.01，高于靜脈移植MSCs組，P<0.05。EF(％)比較，超聲+微泡+MSCs組較PBS組及超聲+微泡組顯著增高(P<0.01)，與靜脈移植MSCs組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雙平面Simpson法EF值超聲+微泡+MSCs組高于PBS組(P<0.01)、超聲+微泡組(P<0.01)及靜脈移植MSCs組(P<0.05)。 結(jié)論： 1.成功實現(xiàn)兔骨髓源性MSCs的分離、純化及培養(yǎng)，密度梯度離心聯(lián)合貼壁

13、培養(yǎng)法是獲取、純化、擴增MSCs簡便、易行的方法。細胞生長曲線、細胞周期、透射電鏡檢測提示培養(yǎng)的MSCs呈低分化狀態(tài)，有較強的自我更新能力。流式細胞儀檢測培養(yǎng)細胞高表達CD44，CD45呈陰性表達，免疫細胞化學檢測CD34陰性，體外成脂、成骨誘導分化成功，判定所獲細胞為MSCs。 2.冠狀動脈左前降支結(jié)扎法可建立穩(wěn)定的兔MI模型，血清學、影像學及病理學檢測可有效評價模型是否成功建立。 3.DAPI作為一種熒光劑，可有效示

14、蹤MSCs在體內(nèi)各臟器、各部位的分布，其方法簡單、操作簡便，可應用于干細胞的標記。 4.診斷超聲聯(lián)合脂膜微泡通過聲孔效應可增加心肌梗死兔心肌血管通透性，為經(jīng)靜脈移植的MSCs歸巢到達缺血心肌提供了更多的通道與機會。微泡介導的超聲窄化效應可刺激超聲輻照心肌缺血區(qū)小血管破裂及炎癥發(fā)生，促進局部VCAM-1等黏附分子的表達，進而增強移植的MSCs向心肌缺血區(qū)聚集與歸巢；同時，診斷超聲介導的微泡破壞效應通過促進VEGF生成與表達、刺激心

15、肌缺血區(qū)血管生成等途徑能更加有效改善心肌梗死后血流灌注。 5.MSCs移植后通過旁分泌效應促進血管生成因子VEGF、歸巢相關(guān)因子SDF-1、黏附分子VCAM-1的表達及抑制凋亡相關(guān)因子Bax表達，進而有效增強MSCs的趨化、黏附、聚集及歸巢能力，通過促進血管新生及抑制凋亡等機制來改善心肌梗死后心功能。 6.靜脈移植MSCs在超聲聯(lián)合微泡介導下通過抑制心肌梗死后膠原纖維形成，抑制心臟重構(gòu)來改善心功能。 7.本研究方