角膜組織工程

1、疑問,（1）到底什么是角膜？,（2）常說的角膜移植是怎么回事？,（3）角膜移植中的角膜來源于哪里？,（4）盲人，近視，遠視，白內(nèi)障都可以進行角膜移植而恢復視力嗎？,角膜,,眼角膜是眼睛前端一層透明薄膜 ，角膜完全透明，位于眼球前部，呈橫橢圓形。角膜有十分敏感的神經(jīng)末梢，如有外物接觸角膜，眼瞼便會不由自主地合上以保護眼睛。,角膜分為五層，組織學上從前向后分為：①上皮細胞層：厚約35μm，由5～6層鱗狀上皮細胞組成，無角化，排列特別整齊，

2、易與其內(nèi)面的前彈力層分離；②前彈力層：厚約12μm，為一層均質(zhì)無細胞成分的透明膜；,,③基質(zhì)層：厚約500μm，占角膜厚度的90%，由近200層排列規(guī)則的膠原纖維束薄板組成，其間有角膜細胞和少數(shù)游走細胞，并有粘蛋白和糖蛋白填充；④后彈力層：為較堅韌的透明均質(zhì)膜，成年人厚約10～12μm；⑤內(nèi)皮細胞層：厚5μm，為一層六角形扁平細胞構(gòu)成，細胞頂部朝向前房，基底面向后彈力層。,,角膜移植,概念 用正常的眼角膜替換患者現(xiàn)有病

3、變的角膜，使患眼復明或控制角膜病變，達到增進視力或治療某些角膜疾患的眼科治療方法。,,,適用癥狀,適合于各種原因造成的角膜混濁或水腫而嚴重影響視力的病變 。例如：病毒性角膜炎 被酸、堿化學物燒傷的角膜混濁患者 先天性角膜變性、圓錐角膜、角膜基質(zhì)變性、角膜內(nèi)皮細胞功能失代償?shù)然颊?角膜腫瘤、角膜瘺、角膜葡萄腫患者 已失明的角膜白斑患者,材料來源,傳統(tǒng) 現(xiàn)代,,,活體捐贈,尸體捐贈,,,活體捐贈,尸體捐贈,人工角膜,

4、活體捐贈顧名思義供體是活人，因外傷、視神經(jīng)疾患、顱內(nèi)疾患等原因?qū)е率鳎o光感）而角膜卻是完好無損的眼球，均是合適的供體。,,返回,人工角膜,基本簡介　　世界上超過1000萬人的眼盲是由角膜病引起，為導致眼盲的第二大原因，僅次于白內(nèi)障。其中80%可以通過角膜移植手術(shù)脫盲。然而，傳統(tǒng)的角膜移植手術(shù)有其兩大弊端，一是角膜供體的來源困難，二是手術(shù)成功率低。人工角膜的出現(xiàn)及應用為角膜盲患者帶來了希望。,基本結(jié)構(gòu),人工角膜是用醫(yī)用高分子

5、材料制成的類似人體角膜的產(chǎn)品 。人工角膜材料,,無機材料,有機材料,生物材料,玻璃，羥基磷灰石 ， 生物玻璃陶瓷,硅凝膠 ，聚甲基丙烯酸甲酯 ，氟碳多聚體,羊膜，動物膠原和殼聚糖，黏多糖,組織工程角膜,,光學鏡柱,周邊支架,聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA）、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA）、硅凝膠、玻璃,陶瓷、氟碳聚合物、羥基磷灰石、生物材料、聚四氟乙烯,,角膜設計中，較為成功的是AlphaCor、Do

6、hlman-Doan和Osteo-Odonto， 并獲得了FDA 批準，進入臨床階段。,種子細胞特點,（1）具有較高的增殖能力 （2）能夠長期維持其生理功能和生物活性,種子細胞（角膜緣干細胞）,1.取材 取一塊大小為1×2mm2，深度為基質(zhì)前的角膜緣組織一塊。,,Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93,,2.培養(yǎng) 采用組織塊培養(yǎng)法和酶消化法。所用的培養(yǎng)基采用DMEM與F－

7、12培養(yǎng)基1：1混合，加入10％胎牛血清，5ng/ml的胰島素，10 ng/ml的上皮生長因子。消化酶使用0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA的混合物。,,,Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93,,觀察培養(yǎng)細胞的生長情況 2－3天換液一次，在倒置顯微鏡下觀察角膜緣上皮細胞的生長情況。 培養(yǎng)細胞標記物染色 將培養(yǎng)的角膜緣上皮細胞固定，進行間接免疫組織化學染色。選用AE5抗角蛋白抗

8、體，特異性識別角蛋白K3；4A4核轉(zhuǎn)錄因子p63的特異性抗體,特異性識別p63。,,3.移植,Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93,角膜緣干細胞理論的建立,1971年，Davanger等研究發(fā)現(xiàn)角膜緣是角膜上皮增殖和移行的動力根源，據(jù)此提出角膜緣干細胞存在的假說 。1986年，Schermer等首次通過試驗發(fā)現(xiàn)角膜緣基底細胞缺乏特異性分化蛋白K3，為角膜緣干細胞的解剖部位提供了間接依據(jù)

9、。,角膜緣干細胞的解剖定位,角膜緣為角膜和結(jié)膜、鞏膜交界的部分 在基底部乳頭形成特殊的“柵欄”(limbal palisades of vogt)樣結(jié)構(gòu),,,結(jié)膜 角膜緣 周邊角膜 中央角膜,角膜緣干細胞理論建立的意義,認知了多種眼表疾病的發(fā)病機理找到了許多眼表重建手術(shù)及角膜移植術(shù)失敗的原因,角膜緣干細胞移植的意義,角膜緣干

10、細胞移植是角膜緣干細胞缺乏患者恢復眼表完整性和重建邊緣屏障作用的有效方法。,角膜緣干細胞移植的局限性,異體供眼來源有限，而且存在免疫排斥反應，可能導致移植失敗。對單眼角膜緣干細胞受損患者的健眼取材（大于2/3圓周）有造成健眼角膜緣干細胞缺乏的潛在威脅 。因此目前認為對角膜緣干細胞先行體外培養(yǎng)擴增后再行移植術(shù)是非常有前景的治療方法。,Chen J, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990;31:1

11、301,載體支架 的特點,（1）生物相容性好 ；（2）細胞能夠正常生長且形成近似體內(nèi)器官的正常結(jié)構(gòu) ；（3）具備角膜特有的透明，透光，透氧的特性 ；,目前常用的載體支架,1 羊膜 2 膠原 3 纖維蛋白4 脫細胞角膜基質(zhì) 5 甲殼素與殼聚糖,羊膜,當胚體下沉，其周圍的外胚層和中胚層向上突起形成羊膜褶，頭褶、尾褶向上生長，側(cè)褶向胚體背中部集中，最后，這些褶全部在胚體尾

12、端背部會合，將胚體全包在膜內(nèi)，內(nèi)層稱羊膜，羊膜腔內(nèi)有羊水，外層稱漿膜，這兩層膜在會合處形成漿羊膜縫。,,,,,,,生物羊膜,,羊膜的制備和保存,將胎盤取出后，立即在層流罩下用含50mg/L青霉素、50mg/L鏈霉素、100mg/L新霉素及25mg/L兩性霉素的平衡鹽溶液清洗表面凝血塊.從絨毛膜間的潛在腔隙中鈍性分離出羊膜，將其上皮面朝上，平鋪于0.45μm微孔硝酸纖維素膜上，切成3cm×4cm大小，儲藏于-80℃，含有Eagl

13、e基質(zhì)和甘油（1∶1）混合液的無菌瓶內(nèi)備用。鑒于羊膜的制作和保存條件不足所帶來的醫(yī)用安全問題，滅菌生物羊膜已上市并投入使用.,,羊膜作為移植底物，是提供基質(zhì)，而不是移植上皮活細胞.羊膜中含有Ⅳ型膠原蛋白（與結(jié)膜中Ⅳ型膠原蛋白相同，可刺激杯狀細胞的分化）、整合素及板層體等多種成分，是結(jié)膜上皮化的合適附著物，為病變組織提供健康的上皮下基質(zhì)環(huán)境.,展望,理想人工角膜應具有以下特點：①優(yōu)良的光學特性，穩(wěn)定的物理化學性質(zhì)。② 能夠與自體角膜組