利用SSH技術(shù)篩選與鑒定小鼠MOE內(nèi)受AC3調(diào)控的差異表達(dá)基因.pdf

1、在哺乳動物中,嗅覺功能的行使依賴兩個主要功能器官,即主要嗅覺表皮(MOE)和犁鼻器(VNO),研究表明MOE內(nèi)嗅覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是由cAMP信號通路介導(dǎo)的。小鼠MOE內(nèi)cAMP信號通路的主要成分包括嗅覺受體、Golf蛋白、腺苷酸環(huán)化酶3(AC3)和環(huán)核苷酸門控離子通道(CNG)等。AC3基因在小鼠MOE內(nèi)的嗅覺信號傳導(dǎo)中起著重要作用,AC3基因缺失不僅能引起小鼠嗅覺功能喪失,甚至還會影響到小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力、生殖能力、體重等方面。但是,A

2、C3基因缺失后,是否會導(dǎo)致MOE內(nèi)與之相關(guān)的基因發(fā)生差異表達(dá),目前還沒有任何了解。抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)是在消減雜交和抑制性PCR擴增基礎(chǔ)上建立起來的篩選差異表達(dá)基因的有效方法,其操作簡捷、準(zhǔn)確率高、假陽性低,已被廣大研究者應(yīng)用于各個領(lǐng)域。因此,本文利用SSH技術(shù)對AC3基因敲除小鼠MOE內(nèi)受其調(diào)控的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選,以期闡釋AC3基因?qū)π∈笮嵊X產(chǎn)生影響的相關(guān)機制。
　　本文以AC3基因敲除(AC3-/-)及其同窩出生的

3、野生型(AC3+/+)小鼠MOE為材料,提取其中的RNA,并反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA,經(jīng)過消減雜交,構(gòu)建了正向和反向兩個消減文庫。采用dot blot方法對消減文庫進(jìn)行初步篩選,并對篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行序列測定及生物信息學(xué)分析。利用熒光定量PCR(qRT-PCR)方法對所篩選的差異表達(dá)基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。
　　在實驗過程中,我們獲得了高質(zhì)量的總 RNA,高效率的接頭連接,對比明顯的巢式第二次PCR結(jié)果,以及獲得了差異程度10

4、-15個循環(huán)的消減雜交效率驗證結(jié)果。利用M13F和M13R引物檢驗文庫中陽性克隆,結(jié)果顯示所挑選的陽性克隆均攜帶100bp以上的目的片段。Dot blot篩選得到386個差異表達(dá)克隆,隨機選取其中的80個進(jìn)行DNA序列測定,經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)有62個在GenBank上獲得與之相匹配的基因信息,其中24個上調(diào)差異表達(dá)克隆對應(yīng)于kcnk3、mapk7、megf11等基因,38個下調(diào)差異表達(dá)克隆對應(yīng)于tmem88b、c-mip、skp1a、ml

5、ycd等基因。利用Gene Ontology(GO)方法對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白功能注釋,并在WeGo網(wǎng)上進(jìn)行統(tǒng)計制圖,發(fā)現(xiàn)它們主要集中在分子結(jié)合、細(xì)胞周期、生物和細(xì)胞過程等功能方面。選取其中上調(diào)基因kcnk3和下調(diào)基因 c-mip、mlycd、tmem88b及 trappc5進(jìn)行 qRT-PCR實驗。結(jié)果表明,在 AC3-/-小鼠MOE內(nèi)kcnk3的表達(dá)量顯著上調(diào),是對照組小鼠的127％,而c-mip、mlycd、tmem88b和t

6、rappc5的表達(dá)量顯著下調(diào),分別為對照組小鼠的20%、7%、32%和29%。
　　上述實驗結(jié)果表明,我們利用SSH技術(shù),成功構(gòu)建了AC3基因在MOE組織內(nèi)的正向與反向消減雜交文庫。并對文庫進(jìn)行了dot blot篩選和qRT-PCR驗證。經(jīng)過DNA測序分析及蛋白質(zhì)功能注釋,發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因與 K+通道、細(xì)胞發(fā)育與分化、脂肪代謝和膜蛋白轉(zhuǎn)運等生物學(xué)功能密切相關(guān)。推測它們可能與 AC3基因共同作用,影響到小鼠MOE內(nèi)嗅覺電位的形成