低濃度Etoposide誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞衰老過程中Hippo通路的影響及組織蛋白酶D表達(dá)變化的研究.pdf

1、目的:依托泊苷(etoposide)作為抗腫瘤藥，可以通過抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA及蛋白質(zhì)合成發(fā)揮抑癌作用。有報道稱:大劑量etoposide可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而小劑量etoposide則能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老。本研究擬對比不同濃度etoposide誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7衰老的差異，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及增殖情況，進(jìn)行衰老相關(guān)β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色，建立低濃度etoposide誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7衰老模型;明確在低濃度

2、etoposide誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7衰老過程中，Hippo通路活性的改變;解析Hippo通路活性的改變對低濃度etoposide誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7衰老的影響;闡明低濃度etoposide誘導(dǎo)MCF-7衰老過程中，組織蛋白酶D的表達(dá)變化。
　　研究方法:
　　1.體外培養(yǎng)MCF-7，分別用不同濃度etoposide(0、3.125、6.25、12.5μM)處理48 h，通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和進(jìn)行衰老相關(guān)β半

3、乳糖苷酶染色來評估細(xì)胞的衰老程度，建立細(xì)胞衰老模型。
　　2.MTS法檢測細(xì)胞活力、繪制細(xì)胞生存率曲線，分析etoposide對細(xì)胞增殖的影響。
　　3.Western blot檢測Hippo通路相關(guān)蛋白、組織蛋白酶等在蛋白水平的表達(dá)變化，包括YAP、p-YAP、LATS1、p-LATS1、CTSD。
　　4.細(xì)胞免疫熒光染色對比etoposide處理后YAP在細(xì)胞內(nèi)分布變化。
　　5.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染抑制p-YAP的生

4、成，明確YAP表達(dá)對腫瘤細(xì)胞衰老的影響。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度etoposide（0、3.125、6.25、12.5μM）誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-748 h，與對照組相比，普通光學(xué)顯微鏡下觀察，etoposide處理組細(xì)胞體積明顯變大、細(xì)胞數(shù)量少，而且衰老特異性SA-β-gal染色陽性的細(xì)胞數(shù)明顯增加，對照組與各實驗組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.不同濃度etoposide處理人乳腺癌細(xì)胞

5、MCF-7后，MTS法檢測發(fā)現(xiàn)etoposide對細(xì)胞增殖抑制作用明顯，并呈劑量依賴性，各組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.Etoposide處理MCF-7細(xì)胞后在不同作用時間點(0 min、5 min、10 min、30 min、1h、4h、24 h、48 h)收集細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p-LATS1呈一過性表達(dá)增高， p-YAP蛋白表達(dá)水平則呈持續(xù)性增高的狀態(tài)。
　　4.不同濃度etoposide處理MCF-7細(xì)胞24h，細(xì)胞

6、免疫熒光染色顯示，對照組細(xì)胞YAP基本在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，隨給藥濃度的增加，YAP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)增加。不同濃度etoposide處理MCF-7細(xì)胞48h后，細(xì)胞免疫熒光染色顯示，各實驗組細(xì)胞中YAP在細(xì)胞核外表達(dá)明顯增加，且表達(dá)量高于誘導(dǎo)24 h，對照組仍然分布于細(xì)胞核內(nèi)。
　　5.通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法誘導(dǎo)YAP持續(xù)入核，抑制YAP蛋白磷酸化，etoposide誘導(dǎo)后，與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，實驗組YAP蛋白細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)減少。
　　6.E