金魚(yú)草delila和rosea1基因在白色棉中的表達(dá)及功能的初步研究.pdf

1、棉花是世界上最重要的纖維作物，彩色棉纖維具有天然色彩、無(wú)需漂染、不含化學(xué)染料殘留、不褪色、穿著舒適和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，在節(jié)約紡織成本的同時(shí)，減輕了化學(xué)染料對(duì)環(huán)境的污染，避免了化學(xué)染料對(duì)人體健康可能存在的有害影響。隨著當(dāng)今社會(huì)人們對(duì)環(huán)境和健康的日益關(guān)注，利用基因工程技術(shù)在不改變品質(zhì)和產(chǎn)量的前提下改變白色棉纖維色澤和直接改良彩色棉纖維品質(zhì)已成為人們研究的熱點(diǎn)。
　　 本研究將控制金魚(yú)草花青素合成基因delila和roseal導(dǎo)入白色

2、陸地棉中，獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株，對(duì)其外源基因進(jìn)行了表達(dá)分析和功能的初步研究。取得的主要結(jié)果如下：
　　 1.為了確定delila和roseal基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子在棉花細(xì)胞中的定位，構(gòu)建delila和roseal基因分別與eGFP基因的嵌合表達(dá)載體，采取農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)朊藁ㄏ屡咻S中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)3-4個(gè)月。挑選愈傷組織于激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光在細(xì)胞中的定位。結(jié)果顯示，delila和roseal基因編碼的蛋白定

3、位于細(xì)胞核中。
　　 2.為了研究delila和roseal基因在棉花中的調(diào)控功能，運(yùn)用Gateway(R)技術(shù)分別構(gòu)建了由花椰菜葉病毒CaMV35S(35S)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)和纖維特異啟動(dòng)子pEX驅(qū)動(dòng)delila和roseal基因表達(dá)的植物表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行了棉花遺傳轉(zhuǎn)化，目前已獲得delila和roseal過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花多個(gè)株系，分別為pGWB408-delila(De1408)的材料獲得32個(gè)系共67株轉(zhuǎn)基因棉花

4、植株；pEX3：：pGWB407-delila(De1407)的材料獲得38個(gè)系共75株轉(zhuǎn)基因棉花植株；pGWB408-roseal(Ros408)的材料獲得33個(gè)系共99株轉(zhuǎn)基因棉花植株；pEK3：：pGWB407-roseal(Ros407)的材料獲得43個(gè)系共91株轉(zhuǎn)基因棉花植株。分別提取了不同植株的基因組DNA(gDNA)，PCR檢測(cè)表明De1408、De1407、Ros408、Ros407植株的陽(yáng)性率分別為：91%、93.9%

5、、76%、85.7%。
　　 3.為了后續(xù)便于篩選純合株系，對(duì)gDNA水平上的鑒定為陽(yáng)性的部分轉(zhuǎn)基因單株進(jìn)行Southern blot。結(jié)果顯示：De1408、De1407、Ros408、Ros407載體中以單拷貝方式插入的株數(shù)分別為6株、9株、7株和4株。
　　 4.為了檢測(cè)轉(zhuǎn)入目的基因的表達(dá)水平，選取以單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行delila和rosea1基因的熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析。結(jié)果顯示：delila基

6、因在De1408中的L2、L4、L7的15 DPA纖維和葉片中均有不同程度的表達(dá)，delila基因在De1407中的L14、L15、L18的15 DPA纖維中均有不同程度的表達(dá)；rosea1基因在Ros408中的L30、L28、L29和L33的開(kāi)花后15天(Days post anthesis，DPA)纖維和葉片中均有不同程度的表達(dá)，rosea1基因在Ros407中的L24、L27、L26和L23的15 DPA纖維中均有不同程度的表達(dá)。

7、delila和rosea1基因在野生型YZ-1中都沒(méi)有表達(dá)，表明外源基因在轉(zhuǎn)基因棉花中已有轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。
　　 5.為了進(jìn)一步研究delila和rosea1基因在棉花葉片色素合成及棉纖維色素沉積中的功能，選取了花青素合成相關(guān)基因DFR、ANS、CHI、F3H和ANR在轉(zhuǎn)基因棉花的15 DPA纖維和葉片中進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明：DFR基因在Ros408轉(zhuǎn)基因棉花植株的15 DPA纖維中表達(dá)量上調(diào)；DFR和ANR基因在Ros408

8、轉(zhuǎn)基因棉花葉片中表達(dá)量上調(diào)；ANR基因在Ros407轉(zhuǎn)基因棉花植株的15 DPA纖維中表達(dá)量上調(diào)，推測(cè)rosea1基因可能調(diào)控DFR和ANR基因進(jìn)而調(diào)控花青素及纖維色素的合成。ANS、CHI和F3H基因在De1408轉(zhuǎn)基因棉花植株的15 DPA纖維中表達(dá)量上調(diào)；ANR基因在De1408轉(zhuǎn)基因棉花植株的葉片中表達(dá)量上調(diào)；DFR基因在De1407轉(zhuǎn)基因棉花植株的15天纖維中表達(dá)量上調(diào)；CHI和F3H基因在De1408轉(zhuǎn)基因棉花植株的葉片中表

9、達(dá)量下調(diào)，推測(cè)delila基因可能調(diào)控DFR、ANS、CHI、F3H和ANR基因進(jìn)而調(diào)控花青素及纖維色素的合成。
　　 6.花青素含量的測(cè)定分析，結(jié)果顯示：在Ros408的三個(gè)株系中植株的大小花蕾、植株莖尖的小葉片、植株的幼嫩苞葉中，花青素含量均顯著升高。表明rosea1基因參與調(diào)控棉花中花青素的合成。
　　 7.對(duì)De1407和Ros407的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因棉花植株的纖維色素的提取及掃描分析，結(jié)果顯示：Ros407和De14