Rho激酶的新型抑制劑WAR5腹腔給藥治療EAE的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)探索并討論腹腔注射新型Rho激酶抑制劑WAR5對MOG35-55免疫誘發(fā)產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）相關(guān)的C57BL/6小鼠模型的療效，進(jìn)而從不同角度探索與討論該藥物對EAE小鼠可能的作用機(jī)制，為日后研發(fā)WAR5在臨床治療MS等多種神經(jīng)系統(tǒng)炎性變性疾病奠定一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　將C57B

2、L/6雌鼠隨機(jī)情況下劃分成EAE對照組和WAR5治療組。EAE模型采用MOG35-55多肽誘導(dǎo)，免疫后第三天開始每日兩次腹腔注射WAR5和生理鹽水，治療到免疫后的第27天停止，治療期間隔天觀察兩組小鼠臨床癥狀的變化，并記錄每只小鼠的體重。免疫后的第28天（p.i.28）犧牲小鼠，固定后留取脊髓標(biāo)本進(jìn)行HE常規(guī)染色和白質(zhì)髓鞘常規(guī)染色，用流式細(xì)胞儀器（Flow CytoMetry，F(xiàn)CM）測定脾臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞M1與M2兩表型狀況。分離腦與脊

3、髓組織，進(jìn)一步提取蛋白，采用Western blot檢測腦與脊髓組織中誘導(dǎo)型的一氧化氮合酶（ iNOS）含量。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism5.0進(jìn)行處理。
　　結(jié)果：
　　1.與EAE對照小鼠比較，腹腔注射WAR5一方面可將EAE小鼠的發(fā)病得到明顯延緩，另一方面還能使其出現(xiàn)的臨床癥狀得到明顯的減輕。腹腔注射WAR5組起病時(shí)間得到了相應(yīng)延長，且小鼠重量減輕程度較對照組小（P＜0.05，P＜0.01）。
　　

4、2. WAR5化合物對EAE小鼠脊髓內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤和髓鞘的丟失起抑制作用。HE染色光鏡下能夠看到EAE小鼠脊髓白質(zhì)中侵潤較多數(shù)量炎性細(xì)胞。神經(jīng)髓鞘進(jìn)行染色光鏡下觀察到EAE鼠的脊髓白質(zhì)分布區(qū)內(nèi)均神經(jīng)纖維髓鞘在不同程度上出現(xiàn)脫失。WAR5治療后能夠顯著地抑制白質(zhì)浸潤炎性細(xì)胞和神經(jīng)纖維的軸索發(fā)生髓鞘的大量丟失。
　　3.與EAE組相比，WAR5組可下調(diào)外周免疫系統(tǒng)中CD16/32陽性M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)（P＜0.01），可見M2型巨

5、噬細(xì)胞CD206有上調(diào)趨勢（P=0.29）。
　　4. WAR5化合物可明顯的使EAE小鼠腦與脊髓當(dāng)中iNOS的表達(dá)水平得到抑制，進(jìn)而經(jīng)腦和脊髓組織中的炎癥反應(yīng)得到抑制，減輕EAE小鼠的脫髓鞘病變和臨床相關(guān)方面的癥狀。
　　結(jié)論：
　　新型Rho激酶抑制劑WAR5衍生物對EAE小鼠的治療效果良好，WAR5腹腔注射可明顯減輕CNS的炎性細(xì)胞浸潤和髓鞘的脫失，還可使CD16/32表型的巨噬細(xì)胞表達(dá)減少，還能夠使 CD206