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文檔簡介
1、目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一類起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病,且其發(fā)病率有逐年上升的趨勢。在過去的幾十年里,AML的治療已有了長足的進步,目前治療的手段主要有聯(lián)合化療和在化療基礎上的造血干細胞移植。傳統(tǒng)化療的毒副作用和耐藥復發(fā)嚴重影響著患者的總體生存率,雖然骨髓移植是根治方法,但由于人類白細胞抗原不相合性以及移植后GVHD產生的風險,故限制了其在臨床的廣泛開展。因此,我們需要尋找新的
2、藥物來優(yōu)化治療方案,減少藥物的毒副作用以及交叉耐藥,以提高患者總體生存率。目前研究發(fā)現(xiàn),白血病細胞基因啟動子區(qū)DNA甲基化的發(fā)生率明顯增高,特別是那些具有抑癌功能的基因啟動子區(qū)發(fā)生的高甲基化。與基因突變不同,DNA甲基化是一種可逆轉的基因修飾過程,故在腫瘤或癌前病變中可以通過去甲基化處理恢復基因的表達,從而達到防治腫瘤的目的。因此,DNA去甲基化作用將為血液系統(tǒng)腫瘤的治療提供新思路。
地西他濱(decitabine,DAC),
3、又稱為5-氮雜-2'-脫氧胞苷,作為一種DNA甲基化轉移酶抑制劑對AML患者包括耐藥、復發(fā)患者已顯示出初步的療效。目前DAC已成功應用于多種血液系統(tǒng)腫瘤,但在聯(lián)合應用方面的研究仍比較少。三氧化二砷(arsenic trioxide,AS2O3)是我國從中醫(yī)藥中發(fā)掘出來的治療急性早幼粒細胞白血病(APL)效果肯定的藥物,已被美國NCCN的AML診療指南列為疾病持續(xù)不緩解或復發(fā)時挽救治療的首選用藥,是中西醫(yī)結合治療成功的經典例證。
4、 近年來,去甲基化藥物不斷應用于臨床,尤其是針對不適合應用標準化療方案誘導緩解的AML患者,然而如何提高藥物療效并減輕副作用是目前一重要課題。本實驗研究DAC、A2O3對HL-60細胞(人急性髓系白血病細胞株)增殖、凋亡的作用以及對死亡相關蛋白激酶(death associatedprotein kinase,DAPK)基因表達的影響,探討去甲基化藥物治療AML的作用機制,旨在為今后臨床用藥提供更多的理論依據(jù)。
方法:
5、 選取AML細胞株HL-60為研究對象,并隨機分組:空白對照組,DAC單藥組(20μ mol/L、40μmol/L、80μmol/L),AS2O3單藥組(1μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L),DAC聯(lián)合AS2O3組(40μmol/L+2.5μmol/L、80μmol/L+2.5μmol/L、40μmol/L+5μmol/L、80μmol/L+5μmol/L), DAC預處理+AS2O3組(1μmol/L、2.5μmol
6、/L、5μmol/L)。評價不同濃度藥物干預不同時間后對HL-60細胞增殖、凋亡的作用以及對DAPK基因表達水平的影響。每組實驗均重復3次。
1、用CCK8法初篩濃度并檢測不同濃度藥物作用24h、48h、72h對HL-60細胞的增殖抑制率;
2、用流式細胞術(FCM)檢測不同濃度藥物作用24h、48h、72h對HL-60細胞的凋亡率;
3、用RT-PCR法檢測不同濃度藥物作用HL-60細胞72h后DAPKm
7、RNA的表達水平;
4、統(tǒng)計學處理。
結果:
1、DAC、AS2O3對HL-60細胞增殖的影響
1.1不同濃度的DAC、AS2O3單藥對HL-60細胞作用24h、48h、72h后,隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,增殖抑制率逐漸升高。DAC對HL-60細胞增殖抑制率由(10.97±1.09)%增加到(61.95±1.24)%,AS2O3對HL-60細胞增殖抑制率由(13.81±3.09)%增加到
8、(84.18±2.94)%。各處理組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC、AS2O3單藥能夠抑制HL-60細胞增殖,并呈時間劑量依賴性。(Fig.1,F(xiàn)ig.2,Table1,Table2)
1.2不同濃度的DAC聯(lián)合AS2O3對HL-60細胞作用24h、48h、72h后,隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,增殖抑制率由(43.22±4.78)%增加到(93.12±3.71)%,各處理組較單藥組比較增殖抑制率顯著
9、增加,且差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC聯(lián)合AS2O3對HL-60細胞增殖抑制作用具有協(xié)同作用。(Fig.3,Table3)
1.3經DAC(80μmol/L)預處理后,不同濃度的AS2O3對HL-60細胞作用24h、48h、72h后,隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,增殖抑制率由(31.8±1.32)%增加到(91.44±0.78)%,較AS2O3單藥組增殖抑制率顯著增加,各處理組間以及處理組與AS2O3單藥
10、組之間差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC預處理可以增強AS2O3對HL-60細胞的增殖抑制作用。(Fig.4,Table4)
2、DAC、AS2O3對HL-60細胞凋亡的影響
2.1不同濃度的DAC、AS2O3單藥對HL-60細胞作用24h、48h、72h后,隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,凋亡率逐漸升高。DAC對HL-60細胞凋亡率由(8.0±1.05)%增加到(36.6±1.35)%,AS2O3
11、對HL-60細胞凋亡率由(10.2±1.35)%增加到(45.3±2.35)%。各處理組間以及處理組與對照組之間差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC、AS2O3單藥能夠誘導HL-60細胞凋亡,并呈時間劑量依賴性。(Fig.5,Table5,Table6)
2.2不同濃度的DAC聯(lián)合AS2O3對HL-60細胞作用24h、48h、72h后,隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,凋亡率由(19.6±0.56)%增加到(62
12、.1±0.71)%,各處理組較單藥組比較凋亡率顯著增加,且差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC聯(lián)合AS2O3對HL-60細胞誘導凋亡具有協(xié)同作用。(Fig.5,Table7)
2.3經DAC(80μmol/L)預處理后,不同濃度的AS2O3對HL-60細胞作用24h、48h、72h后,隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,凋亡率由(18.8±1.32)%增加到(71.4±0.79)%,較AS2O3單藥組凋亡率顯著增加,
13、各處理組間以及處理組與AS2O3單藥組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC預處理可以增強AS2O3對HL-60細胞誘導凋亡的作用。(Fig.5,Table8)
3、DAC、AS2O3對HL-60細胞DAPKmRNA表達的影響
3.1不同濃度的DAC、AS2O3單藥對HL-60細胞作用72h后,隨著藥物濃度的增加,DAPKmRNA的表達水平逐漸升高。DAC對DAPKmRNA的表達量由1.5±0.34增加到
14、3.2±0.56,AS2O3對DAPKmRNA的表達量由1.2±0.50增加到3.0±0.17。各處理組間以及處理組與對照組之間差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC、AS2O3單藥能夠增加HL-60細胞DAPKmRNA的表達水平,并呈劑量依賴性。(Fig.6,F(xiàn)ig.7,Table9,Table10)
3.2不同濃度的DAC聯(lián)合AS2O3對HL-60細胞作用72h后,隨著藥物濃度的增加,DAPKmRNA的表達量由3
15、.6±0.47增加到5.2±0.25,各處理組與單藥組及對照組比較,DAPKmRNA的表達量顯著升高,且差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC聯(lián)合AS2O3能夠增加HL-60細胞DAPKmRNA的表達水平,且兩者具有協(xié)同作用。(Table11)
3.3經DAC(80μmol/L)預處理后,不同濃度的AS2O3對HL-60細胞作用72h后,隨著藥物濃度的增加,DAPKmRNA的表達量由2.0±0.35增加到4.5±0.
16、18,較AS2O3單藥組基因的表達水平顯著升高,各處理組間以及處理組與AS2O3單藥組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。說明DAC預處理可以提升AS2O3對HL-60細胞DAPKmRNA的表達水平。(Table12)
結論:
1、地西他濱和三氧化二砷單藥及聯(lián)合對HL-60細胞均有抑制增殖、誘導凋亡的作用,且呈時間劑量依賴性。
2、地西他濱和三氧化二砷發(fā)揮作用具有協(xié)同效應。
3、經地西他濱預處
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