香魚CXCL8樣蛋白的分子克隆及功能分析.pdf

1、CXCL8是一種 CXC型趨化因子，是動物免疫應答調(diào)控體系的重要組分之一。CXCL8可以由多種細胞分泌產(chǎn)生，例如，在哺乳動物中它可以由巨噬細胞、單核細胞、上皮細胞和中性粒細胞等分泌產(chǎn)生。它可由細胞因子白介素1β（IL-1β)和腫瘤壞死因子α（TNF-α)誘導表達。CXCL8對巨噬細胞、嗜堿性粒細胞、T淋巴細胞，NK細胞等細胞有趨化作用。本研究克隆了香魚 CXCL8(PaCXCL8l)基因的cDNA序列，它由872個核苷酸組成，編碼一個由

2、95個氨基酸組成的、分子量為10.41 kDa的目的蛋白。它的基因組DNA序列由1277個核苷酸組成，包括四個外顯子和三個內(nèi)含子。PaCXCL8l與已知的魚類 CXCL8結(jié)構相似，N端19個殘基為信號肽序列。序列對比表明，PaCXCL8l與大西洋鱈魚的CXCL8氨基酸相似性最高，為83％。熒光定量 P C R檢測發(fā)現(xiàn)，健康香魚的PaCXCL8l的mRNA主要在頭腎和脾組織中表達，此外 PaCXCL8l在體外培養(yǎng)的頭腎來源的單核巨噬細胞也

3、有高表達。鰻利斯頓氏菌感染以后，PaCXCL8l在肝、腦、鰓、頭腎、心、脾和單核巨噬細胞均表達上調(diào)。隨后原核表達了PaCXCL8l，用 Ni2+親和柱純化PaCXCL8l蛋白，利用尿素梯度稀釋法復性蛋白，制備小鼠多抗。Western blot檢測發(fā)現(xiàn) PaCXCL8l蛋白在鰻利斯頓氏菌感染后的香魚單核巨噬細胞表達上調(diào)。進而研究純化復性的PaCXCL8l蛋白對中性粒細胞和單核巨噬細胞的趨化效果，發(fā)現(xiàn) PaCXCL8l蛋白可趨化中性粒細胞和

4、單核巨噬細胞，分別在0.1μg/ml和1.0μg/ml達到最大趨化效果。隨后，香魚腹腔注射 PaCXCL8l蛋白，可有效增加腹腔中性粒細胞和單核巨噬細胞的數(shù)量。此外，PaCXCL8l蛋白體外處理中性粒細胞和單核巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)兩種細胞 IL-1β、TNF-α和IL-10三種細胞因子均表達上調(diào)。通過上述實驗，我們明確 PaCXCL8l蛋白通過對嗜中性粒細胞作用，參與機體的炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)。該工作為進一步深入研究 CXCL8在魚類抗細菌免疫