KISS1基因免疫去勢效果及機制的研究.pdf

1、沿襲千年的手術(shù)去勢正受到規(guī)?；瘶藴驶竽辽a(chǎn)需求的挑戰(zhàn)，基因免疫去勢新技術(shù)最有希望成為替代者。下丘腦分泌的kisspeptin蛋白由KISS1基因編碼，處于生殖軸控制最上游，通過調(diào)控GnRH的分泌影響繁殖，對動物青春期起始和繁殖的控制起著至關(guān)重要的作用。本研究應(yīng)用基因克隆、RT-PCR、Western blot、酶聯(lián)免疫測定、免疫組化、實時熒光定量PCR、組織HE染色等技術(shù)，選擇生殖軸最上游的KISS1基因作為靶基因構(gòu)建非抗性篩選真核表

2、達質(zhì)粒pKS-asd，在細胞水平測試融合抗原KS的表達，將其免疫公羊，旨在探討KISS1基因免疫去勢的效果、機制、對生長的影響、可逆性和否安全。本研究為開發(fā)高效和低成本的免疫去勢新技術(shù)和新方法提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
　　1.非抗性篩選KISS1真核表達質(zhì)粒pKS-asd的構(gòu)建與鑒定將合成的人KISS1基因克隆到pVAX1載體上，構(gòu)建pVAX1-KISS1質(zhì)粒，然后再將HBsAg-S基因克隆到pVAX1-KISS1質(zhì)粒上，構(gòu)建p

3、KS質(zhì)粒，最后利用天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶（asd基因）營養(yǎng)篩選標記取代pKS質(zhì)粒中的卡那霉素(kan)抗性基因篩選標記，構(gòu)建非抗性篩選KISS1真核表達質(zhì)粒pKS-asd。融合基因KS的序列、插入位點和方向經(jīng)測序和酶切鑒定表明是完全正確的;pKS-asd質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染HeLa細胞24 h后經(jīng)RT-PCR法檢測到了融合基因KS的正確轉(zhuǎn)錄;pKS-asd質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞48 h后，通過Western blot方法檢測到了融合蛋白KS的正確

4、表達。
　　2.KISS1基因免疫去勢的效果將構(gòu)建的非抗性篩選KISS1基因疫苗pKS-asd和空質(zhì)粒pVAX-asd分三次，間隔三周免疫6頭8周齡公羊，到初免后的第14周進行屠宰。初免后的第4-14周，疫苗免疫組公羊可檢測到特異性的抗kisspeptin抗體;疫苗免疫組公羊睪酮濃度顯著低于對照組公羊(P＜0.05);初免后第6-14周，疫苗免疫組公羊陰囊周長均顯著低于對照組公羊(P＜0.05)，疫苗免疫組公羊睪丸重和睪丸長均顯著

5、低于對照組公羊(P＜0.05)，疫苗免疫組公羊睪丸內(nèi)精原細胞、精母細胞和精細胞的數(shù)量均明顯低于對照組公羊;疫苗免疫組公羊的性行為顯著低于對照組公羊(P＜0.05)。結(jié)論，KISS1基因免疫公羊后，誘導(dǎo)了特異性的抗kisspeptin抗體應(yīng)答，抑制了公羊的性腺功能和性行為，達到了去勢的目的，同時，證明KISS1基因是開發(fā)免疫去勢基因疫苗的一個新靶標。
　　3.KISS1基因免疫去勢的機制①抗kisspeptin抗體特異性中和外周血中

6、的kisspeptin在初免后的第4-14周，抗kisspeptin抗體在疫苗免疫組公羊中均能檢測到，同時，在初免疫后的第6-14周，疫苗免疫組公羊血清中kisspeptin的濃度顯著低于空質(zhì)粒對照組公羊(P＜0.05)，表明KISS1基因免疫產(chǎn)生的抗kisspeptin抗體能夠特異性中和外周血中內(nèi)源性的kisspeptin，從而導(dǎo)致血清中kisspeptin濃度的急劇下降，達到去勢的目的。
　?、诳筴isspeptin抗體穿過血

7、腦、血睪屏障直接發(fā)揮免疫中和作用在睪丸和腦組織中未能檢測到抗kisspeptin抗體的存在，表明KISS1基因免疫產(chǎn)生的抗kisspeptin抗體可能不能穿過血睪或血腦屏障而在睪丸或腦內(nèi)直接發(fā)揮免疫中和作用。
　?、跭ISS1基因免疫對KISS1基因在下丘腦-垂體-性腺軸（HPG軸）中表達的影響疫苗免疫組公羊下丘腦、垂體和睪丸組織中KISS1基因的表達量與對照組沒有顯著差異，表明KISS1基因免疫可能不是通過影響HPG軸中KISS

8、1的合成而達到去勢的目的。
　?、躃ISS1基因免疫對HPG軸中GPR54基因表達的影響疫苗免疫組公羊下丘腦、垂體和睪丸組織中GPR54基因的表達量與對照組沒有顯著差異，表明KISS1基因免疫可能不通過影響HPG軸中GPR54的合成而達到去勢的目的。
　　結(jié)論，KISS1基因免疫去勢的機制可能是通過抗kisspeptin抗體特異性中和外周血中的kisspeptin，從而達到去勢的目的。
　　4.KISS1基因免疫去勢對

9、生長的影響在初次免疫后的第4-14周，疫苗免疫組公羊血清中的睪酮濃度顯著低于空質(zhì)粒對照組公羊（P＜0.05），而疫苗免疫組公羊血清中的雌激素、IGF-1和GH濃度與對照組差異不顯著。疫苗免疫組公羊胰臟和舌組織中KISS1基因的表達量顯著小于對照組，疫苗免疫組公羊胰臟組織中GPR54基因的表達量顯著小于對照組，說明KISS1基因免疫公羊后會在一定程度上影響KISS1及受體GPR54基因在消化系統(tǒng)中的表達。疫苗免疫組公羊的體重與對照組公羊無

10、論在免疫前還是免疫后差異均不顯著。綜上所述，KISS1基因免疫去勢不會影響動物的生長。
　　5.KISS1基因免疫去勢的可逆性將構(gòu)建的非抗性篩選KISS1基因疫苗pKS-asd和空質(zhì)粒pVAX-asd分三次，間隔三周免疫免疫6頭8周齡公羊，到初免后第30周進行屠宰。疫苗免疫組公羊均能發(fā)現(xiàn)抗kisspeptin的抗體，此外，疫苗免疫組公羊血清中的睪酮水平顯著低于對照組公羊(P＜0.05)，隨著時間的推移，疫苗免疫組抗體水平逐步下降，

11、血清中睪酮的濃度也逐步提高。在初免后第6-22周，疫苗免疫組公羊陰囊周長均顯著低于對照組公羊(P＜0.05)，然而，在初免后第30周，疫苗免疫組公羊陰囊周與對照組公羊差異不顯著。在初免后第30周，疫苗免疫組公羊睪丸重、睪丸長和睪丸寬與對照組差異不顯著，疫苗免疫組公羊睪丸內(nèi)精子、精細胞、精母細胞和精原細胞的數(shù)量與對照組公羊差異不明顯。結(jié)論，KISS1基因免疫對動物睪丸生長發(fā)育的抑制具有可逆性。
　　6.KISS1基因免疫去勢的安全性