天然藥物金納多誘導人脂肪間充質(zhì)干細胞神經(jīng)向分化的濃度優(yōu)化條件研究.pdf

1、目的：觀察金納多注射液能否在體外促進人脂肪間充質(zhì)干細胞(humanadipose-derivedstemcells，hADSCs)向神經(jīng)元樣細胞分化，并探索其安全、有效的最佳誘導濃度，使這種為人熟知的良藥有望在新的干細胞領域為人類神經(jīng)損傷或退行性疾病的治療發(fā)揮更重要的作用。
　　 方法：本研究分為兩部分進行:(1)采用消化法分離純化hADSCs，通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測hADSCs的表面抗原(CD13，CD34

2、，CD45，CD90，CD106)，檢測hADSCs體外成脂肪、成骨分化能力的方法，對hADSCs進行鑒定，并進行體外培養(yǎng)及擴增。(2)配制含金納多藥物濃度分別為0.3、0.6、1.3、1.9和2.6g/L的5組含藥培養(yǎng)基和不含藥正常培養(yǎng)基，分別對hADSCs進行誘導分化。倒置顯微鏡下觀察不同藥物濃度在不同時間點作用于細胞的形態(tài)變化，誘導至第14d時采用免疫熒光染色技術檢測神經(jīng)元骨架蛋白微管相關蛋白-2(microtubule-asso

3、ciatedprotein2，MAP-2)、神經(jīng)生長相關蛋白-43(growthassociatedprotein-43，GAP-43)、突觸功能蛋白突觸素(synaptophysin，Syn)、神經(jīng)細胞功能活性的形態(tài)指標尼氏小體(NisslBody)的表達情況;MTT法檢測0.3-2.6g/L之間8組濃度的金納多對hADSCs作用后的細胞活性曲線;確定金納多是否具有神經(jīng)向誘導作用及其發(fā)揮作用的安全濃度范圍。優(yōu)化濃度條件，選擇1.6g/

4、L濃度組為主要對象進行檢測和驗證。流式細胞儀檢測1.3-2.6g/L之間4組濃度的金納多對hADSCs細胞凋亡率的影響，倒置顯微鏡下觀察在不同時間點細胞的形態(tài)變化，分別于誘導后第3d、7d、10d、14d、21d采用細胞免疫熒光化學法檢測神經(jīng)前體細胞特異性標記物神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、MAP-2、GAP-43、Syn、Nissl和神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性標記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GF

5、AP)的表達情況，計算陽性細胞率。
　　 結果：(1)體外分離培養(yǎng)的hADSCs穩(wěn)定傳代后形態(tài)呈長梭形，旋渦狀生長，可穩(wěn)定擴增15代以上并高表達ADSCs表面抗原CD90、CD13，而淋巴和造血系細胞標志CD34，、CD45、CD106均呈低表達;成脂肪誘導30d后可見脂滴生成，成骨誘導30d后可見礦化結節(jié)形成;所提取和培養(yǎng)的細胞可鑒定為hADSCs。(2)經(jīng)金納多低濃度(0.3g/L、0.6g/L、1.3g/L)組誘導后的hA

6、DSCs形態(tài)在短暫的神經(jīng)元樣形態(tài)改變后，恢復至原長梭形形態(tài);高濃度(1.9g/L、2.6g/L)組誘導后的hADSCs具有神經(jīng)元的典型形態(tài)并可保持穩(wěn)定。誘導后14d神經(jīng)標記物染色結果顯示:低濃度(0.3g/L、0.6g/L、1.3g/L)組各個標記物表達均為陰性;高濃度(1.9g/L、2.6g/L)組各標記物也均呈陽性表達，但細胞稀少。MTT法檢測金納多作用后hADSCs細胞活性曲線顯示:低濃度(0.3g/L-1.6g/L)組細胞活性與

7、對照組相比無顯著性差異(P＜0.05)，各組間相比無差異性(P＞0.05);高濃度(1.9g/L-2.6g/L)組與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，各組間相比無差異性（P＞0.05）;低濃度組與高濃度組各組間相比均有顯著性差異(P＜0.01)。流式細胞儀檢測誘導后細胞凋亡率顯示:1.6g/L組活性細胞數(shù)與對照組相差不大;1.9g/L組細胞活性明顯降低，并于誘導后第3天開始凋亡。結果說明高濃度組顯著抑制細胞的生長活性，甚至誘導其凋

8、亡;由以上結果確定金納多發(fā)揮其誘導作用的有效、安全濃度范圍為1.3g/L＜X＜1.9g/L。優(yōu)化選取1.6g/L濃度組進行檢測和驗證，發(fā)現(xiàn)1.6g/L組可誘導hADSCs呈現(xiàn)并穩(wěn)定保持典型神經(jīng)元形態(tài)，即細胞呈雙極或多極、并有突觸樣結構形成并在細胞間構成類似神經(jīng)網(wǎng)絡狀連接。免疫熒光檢測結果顯示，1.6g/L濃度組在整個誘導過程中均持續(xù)表達神經(jīng)元標記物Nestin、MAP-2、Syn、GAP-43、Nissl，而神經(jīng)膠質(zhì)細胞標記物GFAP僅

9、有短暫微弱表達。
　　 結論：(1)金納多作為單一誘導劑可誘導hADSCs向神經(jīng)元樣細胞分化，不促進向星形膠質(zhì)細胞分化，且其誘導作用具有濃度依賴性;(2)低濃度(1.3g/L及其以下)對hADSCs生長活性和神經(jīng)向分化均無明顯影響;(3)高濃度(1.9g/L及其以上)對hADSCs可發(fā)揮神經(jīng)向誘導作用，但明顯抑制其生長活性，隨著濃度的增高甚至促進其凋亡;(4)1.6g/L濃度的金納多可穩(wěn)定誘導hADSCs向神經(jīng)元樣細胞分化，同時