含P301L突變的tau轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代建系及其UPS研究.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)是老年性癡呆(AD)的兩個(gè)典型病理改變之一，NTFs的主要成分是異常過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白Tau。本實(shí)驗(yàn)室研究的終目標(biāo)是建立含P301L突變的tau轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究Tau在AD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用，探索tau與胞內(nèi)蛋白降解重要通路——泛素—蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)的關(guān)系，開發(fā)和篩選以Tau為靶點(diǎn)的治療藥物。 本實(shí)驗(yàn)室的前期研究，是將帶有小鼠特異性的神經(jīng)元啟動(dòng)子Thy-1和人的含P

2、301L突變tau基因，通過雄原核顯微注射法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠并傳至第四代。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽性小鼠腦內(nèi)有外源性tau的表達(dá)；海馬及皮層部位具有NFTs的改變；并且具備行為學(xué)改變的趨勢(shì)，但樣本數(shù)太少。 本課題是在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討含P301L突變的tau轉(zhuǎn)基因鼠的行為學(xué)改變及傳代建系；并在轉(zhuǎn)基因鼠上研究UPS。還在SH—SY5Y細(xì)胞株上研究煙堿和膽堿受體拮抗藥對(duì)泛素的影響。 Morris水迷宮結(jié)果顯示，3月齡轉(zhuǎn)基因陽性鼠

3、開始出現(xiàn)行為學(xué)改變趨勢(shì)，6月齡陽性鼠的逃逸潛伏期明顯長(zhǎng)于陰性鼠，在第2、4、5天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；9、12月齡陽性鼠的逃逸潛伏期在第2、3、4、5天均長(zhǎng)于陰性鼠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)中，6、9、12、15月齡陽性鼠的平臺(tái)穿越次數(shù)均多于陰性鼠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，含P301L突變的tau轉(zhuǎn)基因小鼠具有學(xué)習(xí)記憶障礙。 傳代結(jié)果顯示，種內(nèi)繁殖群F1～F5代的攜帶外源性基因的陽性率(％)分別為48.33、45.31、64.1

4、、69.86、63.16，而種間繁殖群F1～F5代的陽性率(％)分別為50、51.35、77.94、87.91、86.36，兩種傳代方式的陽性率間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；種內(nèi)繁殖和種間繁殖群的平均離乳率分別為86.8％和100％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？梢?，種間繁殖的陽性率及離乳率均高于種內(nèi)繁殖。結(jié)果提示，含P301L突變的tau轉(zhuǎn)基因小鼠適合采用種間繁殖的方式傳代保種。 Western blot結(jié)果顯示，外源性Tau蛋白只在陽性鼠各腦組織分

5、區(qū)特異表達(dá)；泛素在陽性小鼠海馬和前額葉皮層的相對(duì)灰度為1319±0.186、1.469±0.131，陰性鼠為1.000±0.075、1.000±0.147，陽性鼠海馬和前額葉皮層的泛素表達(dá)增高與陰性鼠相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而顳葉和項(xiàng)葉皮層的泛素表達(dá)在陰性與陽性鼠間無差異。酶解熒光底物測(cè)定蛋白酶體活性結(jié)果顯示，糜蛋白酶樣活性與胰蛋白酶樣活性在陽性鼠海馬、糜蛋白酶樣活性與酸中毒樣水解酶活性在陽性鼠前額葉皮層均較陰性鼠低。推測(cè)在與學(xué)習(xí)記憶密切相

6、關(guān)的海馬和前額葉皮層，異常Tau蛋白表達(dá)促使機(jī)體動(dòng)員更多的泛素進(jìn)行底物泛素化，以促進(jìn)其消除。但異常的Tau本身可以抑制蛋白酶體活性，阻礙異常Tau蛋白的降解，從而導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)的出現(xiàn)以及神經(jīng)元死亡的發(fā)生。 前期實(shí)驗(yàn)顯示：煙堿可誘導(dǎo)SH—SY5Y細(xì)胞泛素表達(dá)上調(diào)，并拮抗凋亡。本課題在此基礎(chǔ)上，研究三種膽堿能受體拮抗劑對(duì)煙堿誘導(dǎo)泛素上調(diào)的影響。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α—銀環(huán)蛇毒素及美加明都可以濃度依賴的抑制煙堿誘導(dǎo)的