乏氧-輻射雙誘導pHRE-Egr-l-Dbait基因聯(lián)合放療對乏氧A549細胞放射敏感性的實驗研究.pdf

1、目的:探討乏氧/輻射雙誘導pHRE/Egr-1-Dbait基因對乏氧A549細胞放射敏感性的影響及其作用機制。
　　 方法:取對數(shù)生長期的A549細胞,將其分為四組:空白組、Dbait組、Egr-1-Dbait組和HRE/Egr-1-Dbait組,分別與綠色熒光蛋白(GFP)標記的質粒(pcDNA3.1/GFP、pcDNA3.1/GFP-Dbait、pcDNA3.1/GFP-Egr-1-Dbait、pcDNA3.1/GFP-HR

2、E/Egr-1-Dbait)共轉染4h,每組按給氧濃度(常氧;5％氧和2.5％氧)分成三個亞組,培養(yǎng)24h,單次照射10Gy后,繼續(xù)培養(yǎng)12h。RT-PCR檢測各組轉染細胞中基因表達情況;流式細胞術檢測細胞凋亡;單細胞凝膠電泳實驗檢測細胞尾DNA比例;細胞克隆形成實驗,擬合細胞存活曲線,根據(jù)相關參數(shù)值(D0、Dq、N值、SF2、SER)檢測pHRE/Egr-1-Dbait基因在乏氧條件下對A549細胞放射敏感性的影響。
　　 結

3、果:
　　 1、各組轉染細胞,經RT-PCR檢測結果顯示:Dbait組、Egr-1-Dbait組、HRE/Egr-1-Dbait組分別出現(xiàn)32bp、482bp、780bp的條帶。
　　 2、流式細胞術檢測細胞凋亡率結果顯示:在非照射時,氧濃度對各組細胞的凋亡率無明顯的影響;當給予10Gy照射后,各質粒轉染組細胞凋亡率在常氧及乏氧條件下與空白組相比,差異均有統(tǒng)計學意義;分析空白組、Dbait組、Egr-1-Dbait組細胞

4、凋亡率,常氧狀態(tài)下高于乏氧(5％、2.5％)條件下,而乏氧(5％、2.5％)組之間凋亡率均無統(tǒng)計學差異;HRE/Egr-1-Dbait組,乏氧(5％、2.5％)條件下的凋亡率分別為(44.02±1.83、38.02±3.21)高于常氧組(28.65±1.18),乏氧組之間凋亡率有亦有統(tǒng)計學差異。進一步分層分析發(fā)現(xiàn),Egr-1-Dbait組在常氧、氧濃度5％、2.5％乏氧下凋亡率高于相應Dbait組;HRE/Egr-1-Dbait組在氧濃

5、度5％、2.5％乏氧下凋亡率高于相應Egr-1-Dbait組,而在常氧下兩組之間的凋亡率無差異。
　　 3、單細胞凝膠電泳實驗檢測細胞尾DNA比例顯示:在非照射時,氧濃度對各組細胞尾DNA比例無明顯影響;當給予10Gy照射后,各質粒轉染組細胞尾DNA比例,無論是常氧及乏氧條件下,與空白組相比,均有統(tǒng)計學差異;組內比較發(fā)現(xiàn),前三組(空白組、Dbait組、Egr-1-Dbait組)在常氧狀態(tài)下,細胞尾DNA比例高于乏氧(5％、2.5

6、％)條件下,而乏氧(5％、2.5％)條件下,各組間尾DNA比例均無統(tǒng)計學差異,乏氧(5％、2.5％)時HRE/Egr-1-Dbait組細胞尾DNA比例高于常氧時,進一步分析顯示氧濃度2.5％時細胞尾DNA比例高于氧濃度5％時;常氧下,HRE/Egr-1-Dbait組細胞尾DNA比例為22.29±1.13與Egr-1-Dbait(21.53±1.47)相比,差異無統(tǒng)計學意義;而在乏氧(5％、2.5％)條件下,HRE/Egr-1-Dbait

7、組(25.76±1.09、34.66±2.51)與Egr-1-Dbait組(18.73±1.52、17.58±1.18)相比,差異均有統(tǒng)計學意義。
　　 4、細胞克隆形成實驗結果顯示:氧濃度2.5％乏氧條件下,Dbait組、Egr-1-Dbait組、HRE/Egr-1-Dbait組的SF2分別為0.624、0.589、0.512;增敏比(SER)分別為1.56、1.90、2.17。
　　 結論:Dbait基因本身對A54