LPLUNC1抑制NF-κB和Stat3信號通路的激活抵抗促炎因子IL-6促進的鼻咽癌發(fā)生發(fā)展.pdf

1、[研究背景]
　　 慢性炎癥是腫瘤的第七大生物學特征，慢性炎癥在觸發(fā)腫瘤發(fā)生、促進腫瘤發(fā)展中起著非常重要的作用;炎癥誘導的腫瘤稱為炎癥相關(guān)性腫瘤。鼻咽癌是一種具有明顯地區(qū)差異的惡性腫瘤。鼻咽由于生理和解剖位置的特性，鼻咽上皮細胞時刻受到各種外源病原微生物如EBV和有毒化學物質(zhì)等損害，使得鼻咽粘膜保護機制容易被破壞，極易導致鼻咽慢性炎癥，因而有利于誘導鼻咽癌發(fā)生發(fā)展，因此鼻咽癌也是一種炎癥相關(guān)性腫瘤。然而，鼻咽慢性炎癥如何誘發(fā)鼻咽

2、癌發(fā)生發(fā)展，尤其是在此過程中激活的免疫細胞如巨噬細胞、鼻咽上皮細胞充當何種角色，目前不是很清楚。LPLUNC1基因是我室克隆的鼻咽癌表達下調(diào)的基因?，F(xiàn)有研究表明LPLUNC1基因編碼的蛋白是一種分泌性蛋白，大量存在于鼻咽和呼吸道分泌物、灌洗液和痰液中;LPLUNC1蛋白可借助其BPI結(jié)構(gòu)域行使宿主防御功能，具有殺菌抗炎的作用，而BPI結(jié)構(gòu)域可以抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移。因此，我們對LPLUNC1基因在鼻咽慢性炎癥促進鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用

3、及其相關(guān)分子機制進行了探討。
　　 [炎癥因子刺激鼻咽癌上皮細胞參與炎癥反應(yīng)]
　　 為盡可能的獲取炎癥時各種促炎因子，我們用低濃度LPS(10ng/ml，近似于細菌脂多糖的生理濃度，如細菌感染時)刺激巨噬細胞，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)低濃度LPS可明顯上調(diào)促炎因子TNF-α、IL-6、IL-Iβ和IL-8基因表達，ELISA檢測顯示在巨噬細胞上清培養(yǎng)液中含有大量的促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8。因此，

4、為能更好的在體外模擬炎癥環(huán)境，反映慢性炎癥時鼻咽癌細胞的狀態(tài)，我們收集低濃度LPS刺激和未刺激巨噬細胞培養(yǎng)上清作為條件培養(yǎng)基（分別以D-THP-LPS，D-THP表示）處理鼻咽癌5-8F細胞，檢測促炎因子對5-8F細胞的影響。結(jié)果顯示，無論在mRNA水平還是蛋白水平，鼻咽癌5-8F細胞經(jīng)D-THP-LPS條件培養(yǎng)基處理24小時后，細胞中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8表達明顯增加，D-THP-LPS條件培養(yǎng)基可促進鼻咽

5、癌5-8F細胞增殖，激活NF-κB和Stat3信號通路。說明炎癥微環(huán)境下鼻咽癌上皮細胞可因炎性因子的刺激而激活NF-κB和Stat3信號通路，自分泌促炎因子，維持和擴大局部炎癥反應(yīng)，從而促進鼻咽癌發(fā)生發(fā)展。
　　 [IL-6促進鼻咽癌發(fā)生發(fā)展]
　　 促炎因子IL-6是腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）分泌的主要促炎因子之一，在炎癥促腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有很重要的作用，而目前IL-6和腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）對鼻咽癌發(fā)生發(fā)

6、展的影響不是很清楚。因此我們檢測分析了鼻咽癌組織中IL-6蛋白表達情況和TAMs浸潤程度，IL-6對鼻咽癌細胞生長的影響。采用鼻咽癌組織芯片，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中IL-6和CD68（TAMs分子標記物，表達強弱可以反映TAMs在腫瘤組織中浸潤程度）均呈強陽性表達，IL-6蛋白表達與TAMs浸潤密度正相關(guān)，Kaplan-Meier生存分析顯示IL-6蛋白表達越高或者TAMs浸潤密度越高，鼻咽癌患者預后越差;外源IL-6可促進鼻咽癌

7、細胞增殖、加快細胞周期演進，同時免疫熒光、熒光素酶報告系統(tǒng)及Western blot檢測顯示IL-6可激活NF-κB p65和p-Stat3蛋白。由此說明鼻咽癌組織中TAMs浸潤和IL-6蛋白表達與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，IL-6可通過激活NF-κB和Stat3蛋白促進鼻咽癌發(fā)生發(fā)展。
　　 [LPLUNC1基因抑制鼻咽癌細胞生長]
　　 前期研究顯示LPLUNC1基因在鼻咽癌組織中低表達，可能是鼻咽癌潛在的抑瘤基因。應(yīng)

8、用鼻咽癌組織芯片，免疫組織化學檢測我們發(fā)現(xiàn)LPLUNC1蛋白在正常鼻咽上皮和腺體中高表達，而在大多數(shù)鼻咽癌組織中低表達或陰性表達，LPLUNC1蛋白表達下調(diào)與鼻咽癌臨床進展分期正相關(guān)，Kaplan-Meier生存顯示LPLUNC1蛋白陽性表達的鼻咽癌患者臨床預后明顯好于陰性表達患者，生長曲線繪制、MTT及裸鼠成瘤等實驗均顯示LPLUNC1基因可明顯抑制鼻咽癌細胞生長與增殖;流式細胞和凋亡檢測發(fā)現(xiàn)LPLUNC1基因可引起鼻咽癌細胞G0/G

9、1期阻滯和誘導凋亡;進一步研究顯示，LPLUNC1基因可通過抑制鼻咽癌細胞NF-κB和Stat3信號傳導通路，下調(diào)CDK4、cyclin D1、Bcl-2基因表達，上調(diào)p21、Bax基因表達。隨后我們分別使用Jak2和NF-κB特異性抑制劑(AG490、BAY11-7082)分別阻斷HNE2/Vector、HNE2/LPLUNC1細胞中Stat3和NF-κB信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AG490、BAY11-7082均能明顯抑制鼻咽癌細胞增殖，而

10、LPLUNC1基因與各抑制劑之間具有明顯的協(xié)同作用。上述結(jié)果表明LPLUNC1基因可抑制NF-κB和Stat3信號通路的激活，引起G0/G1期阻滯和誘導凋亡，從而抑制鼻咽癌細胞生長。
　　 [LPLUNC1抑制IL-6介導的NF-κB和Stat3信號通路的激活]
　　 我們研究顯示IL-6可通過激活NF-κB和Stat3促進鼻咽癌細胞生長;組織芯片免疫組化結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中LPLUNC1蛋白表達與IL-6蛋白表達和

11、TAMs浸潤密度明顯負相關(guān)，同時應(yīng)用激光捕獲顯微切割技術(shù)分離獲得純化鼻咽癌和正常鼻咽上皮組織，qRT-PCR檢測也證實鼻咽癌組織中LPLUNC1 mRNA表達與IL-6 mRNA表達明顯負相關(guān)，提示LPLUNC1可能參與炎癥反應(yīng)，具有抑制IL-6分泌和TAMs浸潤的作用。因此，我們探討了LPLUNC1對IL-6促進鼻咽癌細胞增殖的影響。首先我們確證了LPLUNC1可明顯抑制LPS誘導的鼻咽癌細胞和巨噬細胞分泌促炎因子如TNF-α、IL-

12、6、IL-1β和IL-8，參與抗炎反應(yīng);隨后研究發(fā)現(xiàn)，LPLUNC1基因可明顯抑制IL-6對鼻咽癌細胞的促增殖和加速細胞周期演進的作用，熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)盡管HNE2細胞受到IL-6的刺激，LPLUNC1基因仍可明顯抑制NF-κB和Stat3的轉(zhuǎn)錄活性，免疫熒光檢測顯示LPLUNC1基因可明顯抑制IL-6誘導的NF-κB p65和Stat3活化入核，Westemblot檢測也顯示LPLUNC1基因可明顯抑制IL-6誘導的NF-κ3

13、 p65和p-Stat3蛋白表達，NF-κB p65蛋白表達減少的同時伴有IKKβ蛋白表達減少和IκBα蛋白表達增加，p-Stat3蛋白表達減少的同時伴有p-Jak2蛋白表達減少，LPLUNC1基因還可通過抑制IL-6介導的NF-κB和Stat3信號通路的激活，下調(diào)cyclin D1、Bcl-2基因表達，上調(diào)p21、Bax基因表達。因此，LPLUNC1基因可通過抑制IL-6介導的NF-κB和Stat3信號通路的激活，抵抗促炎因子IL-6

14、對鼻咽癌細胞增殖的促進作用。
　　 [LPLUNC1對鼻咽癌5-8F細胞蛋白質(zhì)表達譜的影響]
　　 蛋白質(zhì)是生命活動中生物學功能的真正執(zhí)行者、生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，探討生命活動中尤其是病理過程中發(fā)生改變的蛋白質(zhì)分子具有重大意義。因此，為進一步了解LPLUNC1在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們采用熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)和質(zhì)譜分析技術(shù)獲得了鼻咽癌5-8F細胞過表達LPLUNC1基因前后的差異蛋白質(zhì)變化。共鑒定出44

15、個差異表達蛋白質(zhì)，包括上調(diào)19個，下調(diào)25個。這些差異表達蛋白質(zhì)按其功能分類主要是(1)分子伴侶蛋白;(2)細胞骨架蛋白;(3)參與細胞新陳代謝的酶類或蛋白;(4)信號轉(zhuǎn)導分子;(5)其他蛋白。結(jié)果表明LPLUNC1基因可能通過調(diào)控上述蛋白分子表達參與細胞代謝、增殖、轉(zhuǎn)錄以及信號轉(zhuǎn)導等生物學過程，從而影響鼻咽癌的生長。隨后，我們對上調(diào)差異蛋白Prohibitin（PHB）、下調(diào)差異蛋白hypoxia up-regulated1 prec

16、ursor(HYOU1)和calreticulinprecursor variant(CALR)進行了驗證。結(jié)果顯示，LPLUNC1基因轉(zhuǎn)染5-8F細胞前后上述差異蛋白質(zhì)表達確實存在差異，與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致;對Prohibitin蛋白進一步研究發(fā)現(xiàn)，Prohibitin蛋白在正常鼻咽組織中呈高表達，而在絕大部分鼻咽癌組織中呈低表達，Prohibitin蛋白表達降低與鼻咽癌的臨床進展分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)，Kaplan-Meier生存分析和多因素