脂氧素A4干預TNF-α誘導的人肺微血管內(nèi)皮細胞ERK、JNK MAPK通路的研究.pdf

1、目的:觀察脂氧素A4(AT-Lipoxin A4)對腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosisfactorα，TNF-α)誘導的人肺微血管內(nèi)皮細胞(Human pulmonarymicrovascular endothelia cells，HPMECs)炎癥相關通路ERK、JNKMAPK的影響并初步探討其可能的分子機制。
　　方法:通過慢病毒轉(zhuǎn)染基因沉默技術，使人肺微血管內(nèi)皮細胞TNF-R2(P75)不表達，僅表達TNF-R1

2、(P55)，使實驗結(jié)果均表現(xiàn)為TNF-R1(P55)通路的效應-即炎癥反應。實驗分為兩組即Ⅰ慢病毒轉(zhuǎn)染基因沉默P75組(n=3)和Ⅱ正常人肺微血管內(nèi)皮細胞組(n=3)，我們通過脂氧素A4(AT-Lipoxin A4)干預，其作用也主要集中在炎癥反應。本實驗研究Ⅰ、Ⅱ兩組各再分為四亞組:(1)對照組、(2) TNF-α單獨刺激組、(3) LXA4(50ng/ml)預處理組和(4) LXA4(50ng/ml)單獨干預組。實時熒光定量PCR檢

3、測HPMECs白介素-8（Interleukin-8，IL-8）mRNA表達水平。細胞免疫熒光以及蛋白質(zhì)免疫印跡Western blot方法對HPMECsTNF-α受體下游關鍵信號分子如TRAF2、RIP、TRADD的定位定量檢測;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot）方法檢測炎癥反應的關鍵細胞因子VCAM-1(Vascular celladhesion molecule1)、E-Selectin(also known as End

4、othelial leukocyteadhesion molecule-1，and CD62E)的表達水平;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot）方法檢測正常HPMECs以及TNF-α p75(-·-)HPMECs ERK MAPK、JNK MAPK磷酸化水平;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)方法對TNF-α p75(-·-)HPMECs細胞核內(nèi)和細胞漿蛋白中NF-κ B/p65水平的檢測以及NF-κ B/p65磷酸化水平

5、的檢測。
　　結(jié)果:(1) LXA4細胞毒性試驗在0-70ng/mL范圍內(nèi)進行，結(jié)果表明lXA4在本實驗用量(50ng/mL)對細胞無毒性(2) LXA4在4小時點可以抑制TNF-α誘導的IL-8表達的上調(diào)。(3) LXA4在6小時點可以抑制TNF-α誘導的HPMECs炎癥反應的關鍵細胞因子VCAM-1、E-Selectin表達的上調(diào);(4)Ⅰ慢病毒轉(zhuǎn)染基因沉默P75組和Ⅱ正常人肺微血管內(nèi)皮細胞組相比較， LXA4預處理1h可以抑

6、制TNF-α引起的HPMECs細胞核內(nèi)TRAF2、RIP、TRADD蛋白水平升高;(5)Ⅰ慢病毒轉(zhuǎn)染基因沉默P75組和Ⅱ正常人肺微血管內(nèi)皮細胞組相比較， LXA4預處理1h均可以抑制TNF-α誘導的HPMECs ERK、JNK磷酸化水平的上調(diào)。(6)Ⅰ慢病毒轉(zhuǎn)染基因沉默P75組與Ⅱ正常人肺微血管內(nèi)皮細胞組相比較，LXA4預處理1h可以抑制TNF-α引起的HPMECs NF-κ B/p65的磷酸化及由細胞質(zhì)向細胞核的轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論