FAM40A基因在家族性FSGS發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:據(jù)國外報(bào)導(dǎo)FSGS(focal and segmental glomerulosclerosis)在成人原發(fā)性腎病綜合征中占12-35％，F(xiàn)SGS包括原發(fā)性、繼發(fā)性和遺傳性/家族性三種。家族性FSGS主要是由于基因突變引起，分為常染色體顯性和隱性兩種遺傳方式，且不同種族突變基因有所不同。家族性FSGS與散發(fā)性FSGS相比，早期臨床表現(xiàn)無明顯差異，容易漏診;但家族性FSGS發(fā)病更早，對(duì)治療反應(yīng)相對(duì)較弱，更易進(jìn)入終末期腎臟病。我們課題

2、組在臨床工作中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)家庭4代36人中，11人經(jīng)腎活檢發(fā)現(xiàn)病理表現(xiàn)為FSGS，且經(jīng)基因診斷，不屬于目前已知的任何一種家族性FSGS。
　　目的:
　　1.通過基因連鎖分析及全外顯子測序確定致病基因;
　　2.通過基因芯片探索發(fā)病機(jī)制;
　　3.通過基因敲除構(gòu)建動(dòng)物模型并驗(yàn)證發(fā)病機(jī)制。
　　方法:
　　1.遺傳方式及致病基因分析:
　　1.1.對(duì)新發(fā)現(xiàn)的FSGS家族進(jìn)行系譜分析;
　　1.

3、2.采用基因連鎖分析和全外顯子掃描查找可能的突變基因。
　　2.表達(dá)譜基因芯片:
　　2.1.表達(dá)譜基因芯片掃描分析，了解與Fam40a相互作用的基因;
　　2.2.利用qPCR、western blotting驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。
　　3.構(gòu)建Fam40a條件性敲除小鼠模型，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:
　　3.1.利用小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)細(xì)胞同源重組技術(shù)和ES細(xì)胞囊胚注射技術(shù)，

4、獲得嵌合雄鼠。
　　3.2.將嵌合雄鼠與C57雌鼠交配獲得flox雜合子小鼠。
　　3.3.flox雜合子小鼠與EIIAcre小鼠雜交，獲得全身敲除的Fam40a(+/-)小鼠;
　　3.4.收集雜合子和野生型小鼠血尿和腎組織標(biāo)本送檢，觀察Fam40a致病情況;利用qPCR、western blotting檢測小鼠腎臟Fam40a和層黏蛋白（laminin）的變化。
　　結(jié)果:
　　1.家系分析及基因掃描<

5、br>　　1.1.通過家系分析發(fā)現(xiàn)本家族性FSGS遺傳方式符合常染色體顯性遺傳;
　　1.2.基因連鎖分析及全外顯子測序?qū)⒅虏』蚨ㄎ坏紽AM40A。
　　2.細(xì)胞模型部分:
　　2.1.基因芯片結(jié)果:與陰性對(duì)照組相比，干擾組Fam40a表達(dá)量下調(diào)，編碼laminin的基因lamb1、lamb2表達(dá)量下調(diào);
　　2.2.qPCR、western blotting結(jié)果:與陰性對(duì)照組相比，干擾組lamb1，lamb2

6、表達(dá)量減少;Western blotting發(fā)現(xiàn)干擾組laminin表達(dá)量減少。
　　3.動(dòng)物模型部分:
　　3.1.成功構(gòu)建了flox雜合子小鼠;
　　3.2.成功構(gòu)建了Fam40a雜合子;
　　3.3.臨床指標(biāo):①8周齡的Fam40a雜合子小鼠出現(xiàn)尿蛋白排泄增多②血清檢測:肌酐尿素氮在正常值范圍。
　　3.4.病理指標(biāo):①光鏡:無明顯病理改變②電鏡:雜合子組:基底膜增厚、皺縮，足細(xì)胞節(jié)段融合;③免疫組化

7、:與野生型組相比，雜合子組小鼠腎臟Fam40a表達(dá)量降低，laminin沿GBM走行，表達(dá)減少。
　　3.5.野生型對(duì)照組與模型組腎組織中Fam40a、laminin檢測:
　?、賠eal time PCR顯示:與野生型相比，雜合子組小鼠Fam40a、lamb1、lamb2表達(dá)量下降;
　?、趙estern blotting顯示:雜合子小鼠腎組織Fam40a和laminin蛋白表達(dá)較野生型降低;
　　結(jié)論:通過系

8、譜分析和基因檢測，我們發(fā)現(xiàn)此家系患者遺傳方式符合常染色體顯形遺傳，突變基因?yàn)镕AM40A。小鼠Fam40a敲除雜合子模型（Fam40a+/-）于出生后8周末出現(xiàn)明顯蛋白尿，電鏡表現(xiàn)為足突融合，GBM增厚、皺縮。在Fam40a雜合子小鼠和干擾Fam40a足細(xì)胞中，laminin的表達(dá)受到影響。
　　綜上所述:FAM40A對(duì)維持腎小球?yàn)V過功能非常重要，它的變化將引起足細(xì)胞和基底膜病變進(jìn)而導(dǎo)致蛋白尿;FAM40A可能通過影響lamini