MULT-和MULT1S轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定和初步分析及γδT細(xì)胞對類脂A識別機(jī)制的研究.pdf

1、NKG2D是一種激活性受體，由同源二聚體構(gòu)成，可表達(dá)于NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、CD8+αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表面，在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中都起著非常重要的作用。近年來，UL16結(jié)合蛋白（ULBPs）作為一類新發(fā)現(xiàn)的人NKG2D配體家族日益受到關(guān)注。MULT1及其的剪切變體MULT1S，是ULBPs在小鼠的同類物，是小鼠的NKG2D配體。MULT1在正常的細(xì)胞膜上不表達(dá)或表達(dá)水平很低。在病理條件下，如在應(yīng)激細(xì)胞、細(xì)菌或病毒

2、感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，MULT1表達(dá)可上調(diào)，并通過與小鼠NKG2D受體結(jié)合，介導(dǎo)抗感染和腫瘤免疫。
　　 MULT1/MULT1S是跨膜蛋白，其胞內(nèi)段較長，除了通過NKG2D受體介導(dǎo)抗感染和腫瘤免疫外，是否還具有其它功能，如是否與胸腺的發(fā)育有關(guān)，是否有反向的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能以及抗原提呈細(xì)胞上是否會表達(dá)MULT1/MULT1S作為危險信號或作為協(xié)同刺激分子發(fā)揮作用，MULT1和MULT1S兩者在功能上有何區(qū)別等問題，目前文獻(xiàn)尚無報道，

3、有必要進(jìn)一步的研究。因此，我們建立了MULT1/MULT1S的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，旨在通過過表達(dá)MULT1/MULT1S，比較兩種轉(zhuǎn)基因小鼠MULT1/MULT1S在組織中的表達(dá)及其對免疫系統(tǒng)的影響，以了解它們的免疫學(xué)功能。
　　 本論文的第一部分主要是將構(gòu)建的兩個品系的轉(zhuǎn)基因小鼠MULT1 Tg（3's和4's）及3個品系的MULT1S Tg（7's、10's和41's）與野生型C57BL/6小鼠交配，以產(chǎn)生F1代小鼠，并對F1代

4、小鼠進(jìn)行基因型和表型的鑒定，為篩選符合進(jìn)一步研究需要的轉(zhuǎn)基因小鼠提供依據(jù)。通過提取F1代轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組DNA進(jìn)行基因組PCR及Southern blotting，以鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型。結(jié)果獲得鑒定陽性的小鼠3's25只、4's13只、7's16只、10'S42只和41's9只。對小鼠尾部組織和尾血mRNA的實時定量RT-PCR檢測結(jié)果表明，3's和4's品系的MULT1Tg小鼠以及10's和41's品系的MULT1STg小鼠的基

5、因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物陽性，可用于進(jìn)行下一步研究。應(yīng)用流式細(xì)胞分析以及免疫組化對MULT1Tg小鼠多種組織細(xì)胞進(jìn)行初步分析的結(jié)果顯示，MULT1主要表達(dá)在胸腺和小腸上皮間淋巴細(xì)胞，在脾細(xì)胞上基本不表達(dá)，且在小腸上皮間淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)與小鼠的年齡有關(guān)。這提示下一步研究應(yīng)主要開展胸腺、腸道及皮膚組織的相關(guān)研究。
　　 本文的第二部分是有關(guān)人γδT細(xì)胞對類脂A的識別機(jī)制的研究（此部分與崔永春博士共同完成）。首先，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、3H-TdR摻入

6、實驗和羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）染色方法分別檢測了在加與不加單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞（monocyte-derived dendritic cell，moDC）的條件下，類脂A誘導(dǎo)人外周血來源的γδT細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，當(dāng)moDC存在時，LA能誘導(dǎo)人類γδT細(xì)胞明顯增殖，而無moDC存在時，基本上觀察不到γδT細(xì)胞有增殖

7、現(xiàn)象。這提示γδT細(xì)胞僅識別由moDC遞呈的LA抗原。其次，抗CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、TCRγδ、LA、MHCⅠ和MHCⅡ抗體對LA誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞增殖的阻斷實驗結(jié)果表明，只有抗CD1b、CD1c、TCRγδ和LA的抗體能明顯阻斷LA誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞增殖，而其它抗體沒有此阻斷效應(yīng)；提示γδT細(xì)胞對LA的識別，是由moDC細(xì)胞提呈，由moDC細(xì)胞上的CD1b和CD1c分子介導(dǎo)，并依賴于TCRγδ的過程。最后，對LA反應(yīng)性γ