和厚樸酚誘導(dǎo)人白血病HL60細(xì)胞系產(chǎn)生線粒體相關(guān)程序性死亡的研究.pdf

1、和厚樸酚是從天然植物厚樸中提取的單體成分，已知其有多種藥學(xué)作用，并且能誘導(dǎo)某些人類腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)其引發(fā)非凋亡類程序性死亡的研究，至今還無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本論文旨在通過(guò)對(duì)和厚樸酚誘導(dǎo)HL60細(xì)胞產(chǎn)生死亡的研究，部分明確這種非凋亡的程序性死亡模式及調(diào)控機(jī)理。主要研究?jī)?nèi)容如下： 1.和厚樸酚抑制HL60細(xì)胞生長(zhǎng)，其細(xì)胞毒性呈劑量及時(shí)間依賴性MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和厚樸酚對(duì)HL60細(xì)胞毒性呈濃度依賴性，導(dǎo)致半數(shù)死亡的藥物濃度(IC50)約是

2、13.47μg/ml。一定濃度和厚樸酚作用不同時(shí)間后，乳酸脫氫酶法檢測(cè)細(xì)胞死亡率，死亡比例呈時(shí)間依賴性升高。 2.和厚樸酚誘導(dǎo)HL60產(chǎn)生的死亡過(guò)程不依賴于caspase激活50μMcaspase總抑制劑zVAD-FMK與15μg/ml和厚樸酚聯(lián)合處理HL60細(xì)胞12小時(shí)后，PI檢測(cè)細(xì)胞死亡率。加入zVAD-FMK后細(xì)胞死亡率為44.95％±3.63％，較和厚樸酚單藥組(53.01％±3.52％)無(wú)顯著差異(p＞0.05)，zV

3、AD-FMK無(wú)顯著抑制效果。此外，15μg/ml和厚樸酚處理HL60細(xì)胞6,12,24小時(shí)后，試劑盒檢測(cè)caspase-3活性，與正常對(duì)照組比值分別為：1.24±0.04，1.59±0.30，1.37±0.19，與對(duì)照組相比均無(wú)顯著增高(p＞0.05)，caspase-3無(wú)激活。 3.和厚樸酚誘導(dǎo)HL60死亡過(guò)程中不引起AIF轉(zhuǎn)位免疫熒光反應(yīng)進(jìn)行AIF轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)。激光共聚焦顯微鏡拍照結(jié)果顯示，15μg/ml和厚樸酚處理HL60細(xì)胞

4、12小時(shí)后，AIF蛋白熒光區(qū)域與細(xì)胞核熒光區(qū)域無(wú)交疊，AIF蛋白沒(méi)有出現(xiàn)轉(zhuǎn)位。 4.和厚樸酚對(duì)HL60細(xì)胞周期無(wú)明顯影響，DNA電泳也不出現(xiàn)梯帶化15μg/ml和厚樸酚作用HL60細(xì)胞12小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，未出現(xiàn)明顯的周期變化及亞二倍體凋亡峰。15μg/ml和厚樸酚處理HL60細(xì)胞6、12、18小時(shí)后，DNA-ladderingKit提取DNA，瓊脂糖電泳檢測(cè)，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)DNA梯帶。 5.透射電鏡觀察和厚樸酚

5、處理后的HL60細(xì)胞，未出現(xiàn)凋亡特征形態(tài)15μg/ml和厚樸酚處理HL60細(xì)胞8小時(shí)后，收集細(xì)胞，樣品處理包埋切片后，透射電鏡觀察可見(jiàn)，和厚樸酚處理后，HL60細(xì)胞核沒(méi)有較大的變化，胞膜較為完整，也沒(méi)有內(nèi)容物溢出。但出現(xiàn)線粒體異常，胞漿內(nèi)可見(jiàn)多層膜包裹的渦旋體結(jié)構(gòu)及大量雙層膜的泡狀結(jié)構(gòu)。 6.和厚樸酚誘導(dǎo)HL60產(chǎn)生的死亡過(guò)程是時(shí)間依賴性的可逆的用15μg/ml和厚樸酚處理HL60細(xì)胞不同時(shí)間長(zhǎng)度后，將藥物洗凈，換上新鮮的培養(yǎng)液

6、，測(cè)定細(xì)胞死亡率。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，再次測(cè)定細(xì)胞死亡率。結(jié)果可見(jiàn)，藥物處理1或2小時(shí)后撤藥，細(xì)胞死亡比例增加很少，死亡基本可逆。而隨著藥物處理時(shí)間增長(zhǎng)，死亡增加比例也隨之增高，但仍然低于15μg/ml和厚樸酚連續(xù)處理24小時(shí)的死亡率。 7.和厚樸酚誘導(dǎo)HL60細(xì)胞產(chǎn)生的死亡可被CyclosporinA抑制分別用線粒體PT孔抑制劑CyclosporinA(CsA)、BongkrekicAcid(BA)及自噬死亡的抑制劑3-Met

7、hyladenine(3-MA)與15μg/ml和厚樸酚聯(lián)合處理，流式細(xì)胞儀PI檢測(cè)細(xì)胞死亡率。和厚樸酚單獨(dú)用藥組細(xì)胞死亡率6、12、18小時(shí)依次為11.56％±0.34％，51.06％±1.34％，80.07％±2.11％。加入CsA后死亡率依次為4.14％±0.50％，24.93％±1.85％，68.8％±1.20％，較和厚樸酚單藥組有明顯降低(p＜0.05)，而50μMBA、10mM3-MA在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)顯著的死亡抑制作用(

8、p＞0.05)。 8.和厚樸酚處理HL60細(xì)胞引起線粒體線粒體PT孔開(kāi)放，膜電位下降，ROS產(chǎn)生15μg/ml和厚樸酚處理6小時(shí)后，加入1mMcalcein-AM熒光染料及5mMCoCl室溫避光反應(yīng)15分鐘。加入CoCl是為了淬滅胞漿中的染料，只留下線粒體部分的熒光。當(dāng)PT孔開(kāi)放時(shí)，calcein-AM從線粒體溢出，線粒體熒光強(qiáng)度降低，由此檢測(cè)PT孔開(kāi)放情況。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，和厚樸酚處理組PT孔開(kāi)放，綠色熒光明顯較

9、對(duì)照組減弱。加入5μMCsA后，可抑制這一現(xiàn)象。15μg/ml和厚樸酚處理HL60細(xì)胞0、6、12、18小時(shí)后，線粒體染料JC-1染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到JC-1Low細(xì)胞(即低膜電位細(xì)胞)比例增多，分別為3.1％，15.2％，52.0％±2.5％，80.1％。而加入5μMCsA后，JC-1Low細(xì)胞比例有所下降，分別為2.7％，5.4％，24.1％±2.4％，61.9％。用15μg/ml和厚樸酚處理HL60細(xì)胞0、1、3、6、12小時(shí)后

10、，ROS特異性熒光染料H2DCFDA孵育半小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光水平，各樣本均與正常細(xì)胞對(duì)照組相比，取其熒光強(qiáng)度比值進(jìn)行分析。ROS水平在和厚樸酚作用后，呈時(shí)間依賴性上升，加入5μMCsA后ROS升高可被部分抑制。 9.和厚樸酚處理HL60細(xì)胞可特異性上調(diào)CyclophilinD蛋白mRNA水平15μg/ml和厚樸酚處理HL60細(xì)胞1.5，3，6，9小時(shí)后，提取RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)及熒光定量PCR檢測(cè)。RT-PCR反應(yīng)

11、電泳結(jié)果顯示，和厚樸酚處理HL60細(xì)胞1.5,3小時(shí)的CyclophilinD條帶明顯增強(qiáng)，而K562細(xì)胞和厚樸酚組無(wú)增強(qiáng)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)CyclophilinD相對(duì)表達(dá)量與正常對(duì)照比值分別為：2.42±0.42，3.10±0.21，1.71±0.11，1.38±0.31。其中1.5，3，6小時(shí)均較對(duì)照組有顯著升高(p＜0.05)。而15μg/ml和厚樸酚處理K562細(xì)胞1.5，3，6，12，24小時(shí)后，熒光定量PCR

12、結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)CyclophilinD相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著升高(p＞0.05)。10.和厚樸酚在HEK293及MCF-7細(xì)胞中也引起類似死亡現(xiàn)象40μg/ml和厚樸酚作用HEK293細(xì)胞8小時(shí)后，臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)，單藥組死亡比例為49.60％±1.59％，加入CsA后細(xì)胞死亡率為23.96％±5.32％，較單藥組有明顯降低(p＜0.05)。40μg/ml和厚樸酚作用MCF-7細(xì)胞8小時(shí)后，PI檢測(cè)，單藥組死亡比例為37.16％，加入CsA后

13、死亡比例降為13.07％。流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA分析，HEK293細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞經(jīng)40μg/ml和厚樸酚作用8小時(shí)，均未見(jiàn)明顯凋亡峰。40μg/ml和厚樸酚處理HEK293細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞6小時(shí)后，透射電鏡觀察均未出現(xiàn)凋亡形態(tài)，但均見(jiàn)胞漿比例增大，線粒體異常，且均出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的類自噬體泡狀結(jié)構(gòu)，與HL60細(xì)胞經(jīng)和厚樸酚處理后出現(xiàn)的形態(tài)特征基本相同。 結(jié)論：我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，15μg/ml和厚樸酚誘導(dǎo)人白血病HL60細(xì)胞產(chǎn)

14、生的死亡，不依賴于caspase激活和AIF釋放，DNA檢測(cè)和電鏡照片也未發(fā)現(xiàn)凋亡特征變化，說(shuō)明這是一種非凋亡的死亡過(guò)程。死亡過(guò)程中出現(xiàn)PT孔開(kāi)放，膜電位損失和ROS水平增高等現(xiàn)象，PT孔抑制劑CsA可抑制這些現(xiàn)象及細(xì)胞死亡，說(shuō)明這種死亡是與線粒體功能損傷相關(guān)。和厚樸酚可特異性上調(diào)PT孔上CyclophilinD蛋白mRNA，說(shuō)明CyclophilinD蛋白可能在這種死亡過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)MCF-7和HEK293