醛固酮合酶和11-β羥化酶基因多態(tài)性與原發(fā)性醛固酮增多癥發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性研究.pdf

1、原發(fā)性醛固酮增多癥（Primary aldosteronism，PA）是最常見的繼發(fā)性高血壓（Secondary Hypertension，SH）病因之一，以醛固酮的非抑制性自主高分泌紊亂為特征，可以引起低腎素、低血鉀、鈉水潴留和高血壓等癥候群。醛固酮瘤（Aldosterone-Producing Adenoma，APA）是PA最常見的亞型，約占PA 60％，其次是特發(fā)性醛固酮增多癥（Idiopathic Hyperaldosteron

2、ism，IHA），約占PA 30%。醛固酮(Aldodosterone，ALD)在PA的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色。ALD合成的最后關(guān)鍵步驟包括：脫氧皮質(zhì)酮向皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化的11-β羥化反應(yīng)、皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化為18-羥皮質(zhì)酮的18-羥化反應(yīng)和18-羥皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化為ALD的18-氧化反應(yīng)。上述三個步驟均由醛固酮合酶（Aldosterone synthase）催化。編碼該酶的基因是CYP11B2。在腎上腺皮質(zhì)的束狀帶，11-脫氧皮質(zhì)醇在11-

3、β羥化酶的作用下產(chǎn)生皮質(zhì)醇，編碼11-β羥化酶的基因是CYP11B1。研究發(fā)現(xiàn)，CYP11B2和CYP11B1的幾個常見的多態(tài)性位點（如：-344T/C、intron 2W/C、K173R、2803A/G等）與原發(fā)性高血壓 (Essential Hypertension，EH)相關(guān)，并影響ALD的合成。近年來，有關(guān)CYP11B2基因多態(tài)性與PA相關(guān)性研究的報道較少，且多為小樣本研究。另外，尚未見到CYP11B1基因多態(tài)性與PA相關(guān)性研究

4、的報道。
　　 方法：
　　 1. 收集118例正常人血液標(biāo)本，134例APA患者腎上腺皮質(zhì)腺瘤標(biāo)本(88個冰凍標(biāo)本和46個石蠟標(biāo)本)和45例IHA患者腎上腺標(biāo)本(31個冰凍標(biāo)本和14個石蠟標(biāo)本)。采用Dneasy Blood & Tissue試劑盒 (Qiagen公司)提取標(biāo)本DNA，-20℃保存。
　　 2.根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和公共SNP數(shù)據(jù)庫(http://ncbi.nlm.nih.gov/SNP/和http:/

5、/www.hapmap.org/)選擇CYP11B2和CYP11B1基因中頻數(shù)≥0.05、且文獻(xiàn)報道與高血壓病相關(guān)的6個位點（rs1799998、rs4539、rs6414、intron 2W/C、rs6410和rs6387）。
　　 3.對CYP11B2和CYP11B1基因的6個多態(tài)性位點進(jìn)行檢測。其中，intron 2W/C采用2個獨立的PCR反應(yīng)，其余位點均先后采用：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（Polymeras

6、e Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism PCR-RFLP）、MGB-Taqman探針法和測序法。并采用Haploview 4.0分析連鎖不平衡（Linkage Disequilibrium，LD）,在R statistics program 2.7.0程序包中使用SNPassoc 1.5-3 分析Hardy-Weinberg平衡。
　　 4.在 R st

7、atistics program 2.7.0程序包中使用SNPassoc 1.5-3和 Haplo.stats 1.3.8軟件分析CYP11B2和CYP11B1基因多態(tài)性位點與PA的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.基因型鑒定：本研究所選擇的6個雙等位基因多態(tài)性位點除rs6414外，均獲得成功檢測。各基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。Rs6410和rs6387位點之間的LD最為強(qiáng)烈(D’0.

8、66)，LD最弱的是rs4539和intron 2 W/C位點 (D’0.06)。
　　 2. 比較PCR-RFLP法和MGB-Taqman探針法的優(yōu)缺點：檢測rs1799998和rs4539多態(tài)性位點時，MGB-Taqman探針法的誤差率明顯低于PCR-RFLP法（χ2=7.39，P=0.007；χ2=6.34，P=0.012）。采用MGB-Taqman探針法檢測rs1799998和rs4539位點平均所用時間（1h左右）較P

9、CR-RFLP法（6h左右）短，但其費用（15.00元人民幣左右）較PCR-RFLP法（rs1799998位點為6.00，rs4539位點為12.00元人民幣左右）高。
　　 3. CYP11B2和CYP11B1基因型和PA的關(guān)系：APA和IHA組中rs6410位點的A等位基因頻數(shù)顯著高于對照組（P=1.09×10-5，P=0.015）。與對照組相比，APA組中rs6410位點純合子AA基因型和雜合子AG基因型比例較高（P=2.

10、19×10-4）。與對照組相比，IHA組中純合子AA基因型和雜合子AG基因型頻數(shù)僅在年齡、性別和BMI校正后具有統(tǒng)計學(xué)意義（OR=4.06 95% CI 1.31-12.66;OR=2.41，95% CI 1.02-5.72）。本研究中，未發(fā)現(xiàn)rs4539、intron 2 W/C和rs1799998單個多態(tài)性位點與APA和IHA相關(guān)。
　　 4. CYP11B2和CYP11B1單體型和APA的關(guān)系：與對照組相比，AAAWT單體

11、型頻數(shù)在APA中顯著增高（Empirical P=5.0×10-5）。相反，GGAWT單體型頻數(shù)在APA中顯著降低(Empirical P=1.0×10-4)。以年齡、性別和BMI進(jìn)行校正后，發(fā)現(xiàn)AAAWT單體型與APA的發(fā)病風(fēng)險增高相關(guān) (OR=1.44，95% CI 1.19-1.76)，而GGAWT單體型則與APA的發(fā)病危險性降低相關(guān)(OR=0.73，95% CI 0.55-0.97)。
　　 5. CYP11B2-CYP

12、11B1單體型與IHA的關(guān)系：與對照組相比，IHA組單體型AAAWT頻數(shù)增高(P=0.002)。以年齡、性別和BMI進(jìn)行校正后，發(fā)現(xiàn)AAAWT，AGGWT和AGAWC單體型與IHA的發(fā)病危險性增高相關(guān) (OR=1.55，95% CI 1.23-1.96；OR=1.49，95% CI 1.17-1.89；OR=1.40，95% CI 1.04-1.88)。而且，AAAWT在IHA中增高的幅度大于在APA中增高的幅度(OR=1.55比OR=

13、1.44)。
　　 結(jié)論：
　　 1. 在選擇基因多態(tài)性檢測方法時，應(yīng)該根據(jù)所選位點、樣本量大小和實驗室經(jīng)費等情況綜合考慮，選擇最為合適的檢測方法。MGB-Taqman探針法耗時少，效率高，準(zhǔn)確性強(qiáng)。適用于大批量基因多態(tài)性檢測。PCR-RFLP法適應(yīng)于樣本量小，內(nèi)切酶價格低的多態(tài)性位點檢測。
　　 2. CYP11B2和CYP11B1基因多態(tài)性與原發(fā)性醛固酮增多癥的發(fā)病顯著相關(guān)。通過對二者多態(tài)性位點的檢測，有可能