紫萍總黃酮提取、純化工藝及其抗癌、抗氧化損傷的活性研究.pdf

1、紫萍在我國分布廣泛，其全草是《中華人民共和國藥典》收錄的常用中藥材品種之一，具有利尿、發(fā)汗、清熱、解毒的功效；有少量文獻(xiàn)報(bào)道，紫萍也具有防癌、抗癌的功效，但國內(nèi)外未見對紫萍中抗癌活性部位及其抗癌c的相關(guān)報(bào)道。論文以此為切入點(diǎn)，重點(diǎn)研究了紫萍中抗癌活性部位的制備工藝及其抗癌機(jī)理，這對紫萍的活性成分及藥理藥效等方面，具有重要的學(xué)術(shù)研究價(jià)值，同時(shí)對紫萍的利用和開發(fā)具有重要的指導(dǎo)作用。此外，論文自主設(shè)計(jì)、開發(fā)了定量分析薄層色譜圖像的MATLAB

2、程序，這將為中藥現(xiàn)代化中的質(zhì)量評價(jià)方法提供一種新的借鑒和參考。論文的主要內(nèi)容和結(jié)果如下： ①以人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721為試驗(yàn)材料，利用MTT比色法測定藥物作用后細(xì)胞的存活率，確定紫萍中具有抗癌活性的有效部位。結(jié)果表明，紫萍的抗癌活性主要來自于其中所含的黃酮類化合物。各試驗(yàn)樣品中黃酮含量越高，則該樣品對癌細(xì)胞的抑制率也就越大。 ②對從紫萍中提取、純化總黃酮的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。（1）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(3

3、4)正交試驗(yàn)確定了乙醇溶液提取總黃酮的最佳工藝參數(shù)：乙醇濃度60％，提取溫度60℃，料液比為1:10，提取時(shí)間2h，進(jìn)行2次提取。（2）確定了殼聚糖絮凝除雜的最佳工藝條件為：殼聚糖粘度為30 Pa?s，加入量為6％，絮凝溫度為60℃，絮凝時(shí)溶液的pH值為5.5。（3）探討了大孔吸附樹脂法純化紫萍總黃酮的工藝。研究結(jié)果表明，AB-8型大孔吸附樹脂適合于紫萍總黃酮的純化，純化工藝條件為：上柱樣品pH值為5-6，以1BV/h的速度流過樹脂，待

4、吸附平衡后，用4BV的蒸餾水以2BV/h的速度淋洗樹脂，然后用70％的乙醇溶液以1BV/h的流速進(jìn)行洗脫，收集第2-3BV時(shí)的洗脫液，其干燥品中的黃酮純度可達(dá)80％左右。 ③論文以MATLAB軟件為開發(fā)平臺(tái)，自行編寫程序，對薄層色譜圖像中的各個(gè)展開點(diǎn)的物質(zhì)含量進(jìn)行了定量分析，并結(jié)合分光光度法和薄層色譜法，建立了一套多學(xué)科交叉的，簡便、快速、準(zhǔn)確、低成本的評價(jià)藥物質(zhì)量穩(wěn)定性的方法。圖像分析程序的可行性試驗(yàn)結(jié)果證明，該程序的分析結(jié)果

5、與實(shí)際結(jié)果誤差不超過3％，具有實(shí)用價(jià)值，可用于薄層色譜圖像的定量分析。然后，利用論文中建立的質(zhì)量穩(wěn)定性的檢測方法，以黃酮類化合物為研究對象，對相同工藝條件下制備得到的兩批紫萍提取物的質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明兩批樣品中總黃酮的含量和組成是穩(wěn)定的，說明制備工藝具有良好的重現(xiàn)性。 ④以人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和人正常肝細(xì)胞株HL-7702為試驗(yàn)材料，研究了紫萍總黃酮（STF）的抗癌活性，并探討了其抗癌機(jī)理。MTT比色試驗(yàn)結(jié)

6、果表明，不同濃度的STF對SMMC-7721和HL-7702均有不同程度的增殖抑制作用，這種抑制作用表現(xiàn)出劑量-時(shí)間依賴關(guān)系，而各個(gè)試驗(yàn)劑量的STF對SMMC-7721細(xì)胞的毒性均明顯高于HL-7702細(xì)胞。對細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量和細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）等酶活性的測定表明，STF能夠劑量依賴性的降低LDH、SDH和總ALP的活性，但是對總蛋白含量、耐熱型ALP和γ

7、-GT的活性無顯著影響，這些結(jié)果提示，STF能夠?qū)MMC-7721細(xì)胞的代謝活動(dòng)產(chǎn)生影響，但是不能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生分化；流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果表明，100、200和400μg/ml的STF作用于SMMC-7721細(xì)胞后，細(xì)胞周期分布發(fā)生了變化，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞內(nèi)bcl-2蛋白的表達(dá)受到抑制，而p53蛋白的表達(dá)則得到增強(qiáng)。這些結(jié)果提示，STF可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其抗癌活性的。 ⑤以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304為試驗(yàn)

8、材料，選用1mmol/LH2O2作用1h誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷為模型，研究了STF的抗氧化損傷活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，50μg/ml濃度以下的STF對ECV-304細(xì)胞無明顯的毒性。10、25、50μg/ml的STF能夠有效提高H2O2損傷后的細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞中丙二醛（MDA）含量，其機(jī)理可能是STF作用后劑量依賴性的提高了細(xì)胞總抗氧化能力，增加了超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，并且促