NS-398對(duì)人肝癌細(xì)胞株和裸鼠移植瘤MMP-2、MMP-9影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌為我國常見惡性腫瘤之一，其中肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)約占90％以上，其生物學(xué)特征為易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、病死率高。手術(shù)切除目前仍是肝癌的首選治療，但手術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率很高，是造成臨床治療失敗和病人死亡的主要原因。因此研究肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理以及探討新的可行的治療方案具有極其重要的臨床意義。 非甾體類抗炎藥(nonsteroidalanti-inflammatorydrugs

2、，NSAIDs)是一類解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的藥物，近年來人們發(fā)現(xiàn)NSAIDs在抗腫瘤治療方面有一定的療效，其抗腫瘤的理論依據(jù)主要是通過對(duì)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的抑制來實(shí)現(xiàn)的[1-4]。COX是花生四烯酸合成PGE2的限速酶，存在兩種亞型：結(jié)構(gòu)型COX-1和誘導(dǎo)型COX-2。COX-1在多數(shù)正常細(xì)胞中呈穩(wěn)定表達(dá)，負(fù)責(zé)前列腺素的合成而參與生理過程；COX-2在細(xì)胞受到各種刺激因素(生長因子、炎癥介質(zhì)、致癌劑

3、等)的誘導(dǎo)下合成，參與炎癥、疼痛、細(xì)胞增殖、分化、凋亡及腫瘤發(fā)生等多種病理過程。目前對(duì)于COX-2促進(jìn)腫瘤生長的機(jī)制所知甚少。新近研究表明，COX-2的表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及臨床病期密切相關(guān)[5-9]。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)、穿透基底膜(basementmembrane，BM)是關(guān)鍵性的一步，而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)系統(tǒng)在這一過程中起著重要作用。不同的腫瘤細(xì)胞其表達(dá)的M

4、MP亞型有所不同，其中MMP-2與MMP-9與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系報(bào)導(dǎo)最多[10-15]。本研究通過應(yīng)用COX-2特異性抑制劑NS-398對(duì)肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞及其裸鼠移植瘤進(jìn)行藥物干預(yù)，檢測(cè)MMP-2和MMP-9的表達(dá)情況，進(jìn)一步在分子水平探討NS-398在肝癌治療中的化學(xué)預(yù)防作用。 方法：1.對(duì)人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。NS-398取0、25、50、75、100μmol/L5個(gè)濃度組，每個(gè)濃度組選

5、取24h、48h、72h三個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，采用RT-PCR半定量和FCM定量檢測(cè)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度NS-398對(duì)SMMC-7721細(xì)胞MMP-2、MMP-9基因和蛋白表達(dá)的影響。 2.取1×107/ml細(xì)胞懸液接種于BALB/cnu/nu裸小鼠的右腋下皮下構(gòu)建肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤。2周后可觸及皮下瘤塊。16只裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(每組8只)。實(shí)驗(yàn)組給予3mg/kgNS-398腹腔注射，每周3次給藥

6、，給藥9周后處死。 3.測(cè)量兩組移植瘤的長徑、短徑并稱瘤重，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)COX-2特異性抑制劑NS-398對(duì)裸鼠移植瘤MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果：1.通過體外實(shí)驗(yàn)對(duì)肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察不同時(shí)間和不同劑量的NS-398對(duì)MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明：NS-398可抑制SMMC-7721細(xì)胞MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白水平表達(dá)，并且

7、隨劑量的增加和作用時(shí)間的延長而明顯減少，呈顯著地時(shí)間和劑量依賴性(P＜0.05)。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察一定劑量的NS-398對(duì)移植瘤生長的影響。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組腫瘤的體積及重量均明顯小于對(duì)照組(P＜0.05)，隨著用藥時(shí)間的增加，NS-398對(duì)腫瘤生長的抑制作用增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組腫瘤的體積為(0.21±0.14)cm3，對(duì)照組為(1.92±0.94)cm3，體積抑瘤率為

8、89.1％。實(shí)驗(yàn)組腫瘤的重量為(0.40±0.34)g，對(duì)照組為(1.45±0.42)g，重量抑瘤率為72.4％。 3.在檢測(cè)NS-398對(duì)裸鼠移植瘤生長影響的同時(shí)，檢測(cè)NS-398對(duì)移植瘤MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響。對(duì)處理組和對(duì)照組移植瘤組織中MMP-2與MMP-9蛋白表達(dá)的灰度值分別進(jìn)行分析，結(jié)果表明：處理組和對(duì)照組中MMP-2蛋白表達(dá)的灰度值分別為26.71±6.59和67.39±7.02，處理組和對(duì)照組中MMP

9、-9蛋白表達(dá)的灰度值分別為25.55±5.37和62.20±7.19，與對(duì)照組比較，NS-398能夠顯著抑制裸鼠移植瘤MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平(P＜0.05)。 結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)RT-PCR和FCM結(jié)果表明NS-398能顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9基因和蛋白的表達(dá)，并呈顯著的劑量和時(shí)間依賴性關(guān)系。表明COX-2與肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，抑制MMP-2、MMP-9基因和蛋白表達(dá)是NS-398抑制