人群Echo30型腸道病毒感染的血清學檢測方法建立以及流行特征研究.pdf

1、近年來，世界各地埃可30型腸道病毒(Echovirus 30，Ech030)相關(guān)疾病暴發(fā)逐漸增多，我國也連續(xù)有多起暴發(fā)報道。2003年1月至7月，在我國江蘇省北部地區(qū)發(fā)生的較大規(guī)模的兒童無菌性性腦膜炎暴發(fā)流行中，本課題組從患者腦脊液中分離到了Echo30病毒，首次明確本次感染的病原，并對該病毒的生物學特性進行了相關(guān)探討。本研究在此基礎(chǔ)上，依次建立了Echo30國內(nèi)流行株血清特異性IgG抗體的間接免疫熒光試驗(IFA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(

2、ELISA)檢測方法。并初步用于了解人群的Echo30型無菌性腦膜炎隱性感染情況調(diào)查。 在IFA技術(shù)建立過程中，我們使用細胞爬片法，用分離得到的毒株感染人胚肺二倍體細胞(MRC-5)制備抗原片，優(yōu)化了IFA染色程序，確定1:100和1:200兩個血清稀釋度，1:200的異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗人及抗鼠IgG稀釋度及伊文氏蘭襯染為最佳染色條件。用建立的IFA技術(shù)篩檢了71份非暴發(fā)地區(qū)兒童血清，其中得到12份為陽性，59

3、份為陰性；47份暴發(fā)地區(qū)兒童血清中，22份為陽性，25份為陰性。研究發(fā)現(xiàn)人群中存在Echo30型無菌性腦膜炎隱性感染者。所建立的IFA技術(shù)有較好的靈敏度，可初步用于小范圍人群的血清學檢測，但并不適用于大面積人群的血清流行病學調(diào)查。因此，本研究進一步探討了Echo30 IgG抗體的間接ELISA檢測方法。 研究使用分離得到的Echo30病毒株全病毒作為ELISA反應(yīng)體系的抗原，用棋盤滴定法確定ELISA檢測最佳條件，據(jù)陰性樣品OD

4、值分布情況確定cutoff值，建立反應(yīng)體系。結(jié)果確定ELISA反應(yīng)的最佳抗原包被濃度為2.5μg/ml，血清檢測最佳稀釋度為1:200，HRP-羊抗人IgG理想稀釋度為1:5000，Cutoff值定為0.291。研究對ELISA檢測結(jié)果和IFA檢測結(jié)果做了比較，并以IFA為標準對ELISA的靈敏度和特異度進行了評價。結(jié)果確定ELISA檢測結(jié)果與IFA結(jié)果一致率達89.1％，一致性檢驗Kappa值為0.742，ELISA的靈敏度和特異度分

5、別為81.8％和92％。提示兩種檢測方法在可信度上差別不大，均可用于檢測血清抗體，但根據(jù)兩種技術(shù)的操作特點，ELISA技術(shù)更適用于大面積人群的血清流行病學調(diào)杳。 為了了解人群Echo30國內(nèi)流行株引起的無菌性腦膜炎隱性感染情況及保護性分布情況，探索Echo30病毒感染的危險因素，我們使用所建立的ELISA方法，對來自上海市不同年齡的412名健康人和來自浙江省德清縣的289名成人健康體檢者血清進行了Echo30 IgG抗體檢測，并

6、進行了相應(yīng)比較分析。通過對上海市區(qū)人群的分析發(fā)現(xiàn)1歲以下嬰幼兒中未見抗體陽性者，15歲以下兒童抗體陽性率較低(10％～16.7％)，15歲以上人群抗體陽性率水平明顯升高(45.0％～46.7％)。孕婦與普通人群抗體陽性率無顯著性差異。提示上海市人群中存在隱性感染者，人群通過自然感染獲得免疫保護，15歲以下兒童為Echo30感染及發(fā)病的高危人群，母體傳遞給嬰幼兒的抗體水平較低，不能為嬰幼兒提供先天性免疫保護。對浙江農(nóng)村人群的分析發(fā)現(xiàn)浙江農(nóng)

7、村成人的隱性感染情況和上海人群基本相似。在這部分調(diào)查中，我們對Echo30病毒感染的危險因素進行了單因素和多因素分析，遺憾的是，并未發(fā)現(xiàn)有顯著統(tǒng)計學意義的危險因素。 目前，我國尚缺乏常規(guī)的腸道病毒監(jiān)測系統(tǒng)，Echo30信息資料嚴重不足，我們對引起多次腦膜炎暴發(fā)的Echo30具體傳播途徑尚不清楚。根據(jù)本研究的結(jié)果，我們推測Echo30病毒的一般感染可能和兒童時期的特殊行為習慣有關(guān)。如果出現(xiàn)某種特別的危險因素，使Echo30病毒有更