單克隆抗體SZ117對腫瘤細(xì)胞主導(dǎo)的血管擬態(tài)的抑制作用及其機制的研究.pdf

1、腫瘤血管在腫瘤增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。自1971年Folkman首次提出腫瘤血管新生學(xué)說以來，人們普遍接受了腫瘤血管是通過血管新生機制發(fā)展而來的概念，認(rèn)為正常血管內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織遷移，在腫瘤組織中形成的新血管分枝。并據(jù)此研發(fā)了多種藥物抗血管新生藥物，目前已有5種抗腫瘤血管新生藥物用于臨床治療惡性腫瘤，其中Avastin作為重組人抗VEGF單克隆抗體，是第一個經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的抗腫瘤血管新生藥物。然而，研究顯示現(xiàn)有抗血管新生藥

2、物對惡性腫瘤雖有一定的療效，但難以持久；一旦停藥，容易出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等。在抗腫瘤血管藥物研究中，我們需要廣開思路，研發(fā)出特異性和高效的抗腫瘤血管新藥。近年來研究表明惡性腫瘤血管并非都由血管內(nèi)皮細(xì)胞組成。1999年，MaryJCHendrix領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，揭示了另一種與血管新生完全不同的腫瘤血管形成模式——由腫瘤細(xì)胞主導(dǎo)的血管形成，即血管生出擬態(tài)，并且受到越來越多人的認(rèn)可和重視。
　　 本研究應(yīng)用腫瘤細(xì)胞體外matrige

3、l上血管生成擬態(tài)模型，對本實驗室制備的4株單克隆抗體進(jìn)行抗腫瘤血管研究。結(jié)果顯示，針對基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)纖維蛋白連接區(qū)的單克隆抗體SZ117，能夠有效地抑制由腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞3B11和入骨肉瘤細(xì)胞MG63體外類血管結(jié)構(gòu)的形成。明膠酶譜實驗結(jié)果表明，SZ117能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞表達(dá)并分泌的MMP2蛋白酶活性，而對MMP9活性沒有明顯的抑制作用，這說明SZ117可能是通過抑制MMP2活性，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞體外血管擬態(tài)形成。

4、>　　 然而令人驚訝的是，明膠酶譜實驗并沒有在3B11細(xì)胞無血清培養(yǎng)液中檢測到MMP2活性，WesternBlot實驗也同樣沒有檢測到MMP2的表達(dá)，這提示SZ117并不是通過抑制MMP2活性來抑制3811細(xì)胞主導(dǎo)的體外血管擬態(tài)。據(jù)此，我們假設(shè)SZ117還可能通過作用于其他分子靶標(biāo)起腫瘤新生血管抑制作用。接著，我們用WesternBlot、免疫沉淀和質(zhì)譜分析等一系列方法鑒定SZ117識別MMP2以外的分子靶標(biāo)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SZ11

5、7能特異性地識別多種腫瘤細(xì)胞中280kDa的高分子蛋白，經(jīng)免疫沉淀分離和SDS-PAGE純化以及質(zhì)譜分析，鑒定出該280kDa的高分子蛋白為FilaminA。交叉反應(yīng)進(jìn)一步證實為FilaminA。
　　 FilaminA為細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的支架，可與多種蛋白相互作用維持細(xì)胞穩(wěn)定性，直接或間接參與腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲、遷徙。WesternBlot實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)ilaminA不但在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，也存在于腫瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)

6、液中；SZ117能夠檢測出280kDa和53kDa蛋白條帶，利用標(biāo)準(zhǔn)化FilaminA單克隆抗體證實這兩個蛋白條帶分別為FilaminA及其降解片段。此外，我們使用相同的方法，在Matrigel（富含細(xì)胞外基質(zhì)）中也檢測到FilaminA蛋白及其降解片段。這說明多種腫瘤細(xì)胞能夠表達(dá)并分泌FilaminA及其降解片段，并分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中；由此我們推測細(xì)胞外基質(zhì)中的FilaminA也可能促進(jìn)腫瘤新生血管形成。而SZ117有可能通過特異性地

7、與FilaminA蛋白及其降解片段結(jié)合的機制來抑制腫瘤細(xì)胞體外血管擬態(tài)的形成。
　　 另外，在多個白血病病人外周血和骨髓樣本中，SZ117能夠地識別出280kDaFilaminA蛋白，但在正常人外周血和骨髓樣本中卻未能檢測到該蛋白的表達(dá)，提示SZ117有可能特異性地識別腫瘤FilaminA。與FilaminA單克隆抗體幾乎能識別所有filaminA相比，SZ117在識別腫瘤細(xì)胞中的filaminA更具有特異性。由此推測SZ117

8、識別的filaminA具有一定的腫瘤特異性。
　　 通過SZ117識別的MMP2纖維連接蛋白樣區(qū)域(228-392)與filaminA(1300-1612)的比對，MMP2纖維連接蛋白樣區(qū)域與filaminA11~14重復(fù)序列有39個共同識別的氨基酸，雖然SZ117所識別的抗原表位未鑒定，但這可能是SZ117能夠識別filaminA蛋白的基礎(chǔ)?；蛩綑z測此區(qū)域，并未檢測到異常。
　　 考慮到SZ117識別的filami

9、nA蛋白可能在翻譯或翻譯后修飾中出現(xiàn)問題，進(jìn)一步明膠酶譜實驗發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞株中有280kDa條帶能夠降解明膠，由此初步推測SZ117識別的FilaminA蛋白具有一定的異質(zhì)性，可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤。
　　 綜上所述，SZ117-方面能夠通過抑制MMP2活性，進(jìn)而抑制部分MMP2陽性腫瘤細(xì)胞血管擬態(tài)的形成；另一方面，SZ117還能特異性的識別FilaminA，起到腫瘤血管擬態(tài)的抑制作用，提示SZ117具有抗腫瘤新生血管的潛能。本研究