消減免疫法篩選HPV型間雜合顆粒特異單克隆抗體及其表位研究.pdf

1、人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)的持續(xù)感染被證實(shí)是誘發(fā)女性宮頸癌的主要原因。世界范圍內(nèi)，每年由HPV感染所致癌癥病例56萬例，約占全球全部癌癥新發(fā)病例的5％，死亡人數(shù)約20萬;在中國，每年約有10萬的婦女因HPV感染而導(dǎo)致宮頸癌，死亡病例約3萬。宮頸癌是繼乳腺癌之后嚴(yán)重威脅婦女健康的第二大疾病。與宮頸癌密切相關(guān)的高危型HPV有15種，要有效控制宮頸癌就必須有預(yù)防這15種型別HPV感染的疫苗。目前上市的2種疫

2、苗只能預(yù)防HPV16和HPV18這兩種高危型的感染，保護(hù)率約占70％。因此，開發(fā)多價(jià)預(yù)防疫苗具有重大意義，同時(shí)也面臨巨大的挑戰(zhàn)。
　　本文在實(shí)驗(yàn)室前期的研究基礎(chǔ)上，通過HPV16L1的C175和HPV52L1的C428位點(diǎn)突變，獲得兩種突變蛋白，混合組裝成均一的、與野生型VLP形態(tài)相似的雜合病毒樣顆粒(VirusLikeParticle，VLP)。通過免疫原性考察，相同劑量的雜合VLP與野生型VLP所誘導(dǎo)的抗體水平相當(dāng)，表明雜合V

3、LP有作為廣譜HPV疫苗的潛力。由于雜合VLP兩個(gè)相鄰五聚體之間只能形成一個(gè)二硫鍵，在空間結(jié)構(gòu)上必然與野生型VLP不同，因此，雜合VLP有可能會(huì)產(chǎn)生新的功能表位，甚至可能產(chǎn)生新的廣譜表位。因此，篩選出針對(duì)雜合VLP特異反應(yīng)的單抗，同時(shí)通過該抗體分析雜合VLP相對(duì)于野生型VLP所產(chǎn)生的新表位具有重要意義。
　　本研究首先通過單克隆抗體篩選獲得了針對(duì)于雜合VLP特異反應(yīng)的單抗。在常規(guī)的免疫方法中，HPV雜合VLP的免疫血清抗體滴度與兩

4、種野生型免疫的抗體滴度相當(dāng)，篩選獲得的抗體差異性不大，且沒有針對(duì)雜合VLP新表位的單抗。因此本研究采用環(huán)磷酰胺消減免疫法，環(huán)磷酰胺可以抑制非目的抗原的免疫原性，提高免疫系統(tǒng)對(duì)目的抗原的應(yīng)答。本文針對(duì)HPV抗原的免疫進(jìn)行一系列摸索，最后建立的消減免疫方案是:耐受階段和免疫階段均不使用佐劑，抗原劑量為20μg，腹腔注射，環(huán)磷酰胺劑量為100mg/kg。對(duì)消減次數(shù)的研究表明，耐受次數(shù)不影響免疫抑制的持久性，停止環(huán)磷酰胺處理后，免疫抑制狀態(tài)可以

5、維持4周。
　　本研究中，先使小鼠免疫系統(tǒng)對(duì)HPV16和HPV52野生型VLP的免疫無應(yīng)答，再以雜合VLP免疫小鼠，使少量的五聚體雜合特異的表位免疫應(yīng)答得到加強(qiáng)，提高特異抗體的陽性率，減少篩選工作量。篩選獲得的抗體中，有2株抗體對(duì)雜合VLP特異，4株抗體對(duì)雜合VLP和野生型VLP的反應(yīng)差異性在10倍以上。證實(shí)了環(huán)磷酰胺消減免疫法可以有效地制備差異性抗體。
　　我們接著利用分子模擬方法，對(duì)以上抗體識(shí)別的表位進(jìn)行分析。選取雜合V

6、LP的特異性抗體2B3，分別對(duì)抗體可變區(qū)和HPV16/52相鄰五聚體進(jìn)行同源模建和分子對(duì)接，預(yù)測(cè)出2B3與雜合VLP的相互作用區(qū)域在兩個(gè)五聚體之間，關(guān)鍵氨基酸是HPV16五聚體的Ser170和Lys439，HPV52五聚體的Asn240、Ser255、Glu378、Lys382和Glu469。
　　綜上所述，本研究通過對(duì)消減免疫方案的研究，建立了以HPV為抗原的消減免疫方案，由此篩選獲得了雜合VLP特異性抗體和與野生型VLP具有較