ERK通路對血管平滑肌細胞增殖、表型標志蛋白及miRNA-31表達水平的影響.pdf

1、[目的]
　　下肢動脈硬化閉塞(ASO)在西方國家55～75歲人群中發(fā)病率高達17％，每年導致成千上萬的患者發(fā)生肢體殘疾[1]。膝下動脈術后再狹窄發(fā)生率高達40％～60％，截肢率達8％～30％[2]。目前認為血管平滑肌細胞(VSMCs)遷移和增殖是引起新生內(nèi)膜增厚、管腔狹窄的主要原因之一[3]，MicroRNA（miRNA）可作為干預和治療ASO及血管再狹窄的潛在分子靶點[4]。雖然miR-31可通過大腫瘤抑制基因同源物2(LAT

2、S2)促進大鼠VSMC增殖和遷移[5]，但其在人動脈VSMCs中作用及其調(diào)控機制未見報道。
　　本研究采用硬化動脈的原代培養(yǎng)VSMCs，通過阻斷ERK通路進一步明確ERK、miR-31與細胞因子PDGF-BB介導的平滑肌增殖之間的調(diào)控關系;研究結(jié)果將有助于進一步闡明探索動脈粥樣硬化和血管再狹窄發(fā)病機制，也為miR-31干預治療ASO及血管再狹窄提供理論依據(jù)。
　　[方法]
　　1.收集下肢動脈硬化閉塞患者下肢截肢標本，

3、分離動脈平滑肌，用貼壁法原代培養(yǎng)平滑肌細胞。
　　2.相同代數(shù)的第3-6代VSMCs，加入PDGF-BB或PDGF-BB+PD98059分別用CCK-8法、Transwell法、Western blot、Real-time PCR檢測VSMCs增殖、遷移能力、表型標志性蛋白表達以及miR-31表達水平。
　　[結(jié)果]
　　1.經(jīng)組織貼壁法成功培養(yǎng)出原代平滑肌細胞。
　　2.動脈硬化組細胞，經(jīng)過細胞因子血小板源性生

4、長因子-BB(PDGF-BB)誘導的增殖后，CCK-8測到的OD值明顯升高(P＜0.05)，經(jīng)過ERK阻斷劑PD98059處理后能明顯阻滯平滑肌細胞的增殖作用(P＜0.05)。
　　3.Transwell遷移小室實驗發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB(30ng/ml)處理VSMCs顯著增加細胞遷移率，阻斷ERK通路后則明顯減少了PDGF-BB誘導的VSMCs遷移。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比， PDGF-B

5、B處理后動脈硬化細胞收縮表型標志蛋白α-SM-Actin含量顯著下降(P＜0.05)，增殖型蛋白OPN含量顯著升高（P＜0.05）。與PDGF-BB組相比，PD98059+PDGF-BB處理后，α-SM-Actin含量顯著升高(P＜0.05)，增殖型蛋白OPN含量顯著下降(P＜0.05)。
　　5.與空白對照組相比，PDGF-BB處理后miR-31的表達量顯著升高(P＜0.05);與PDGF-BB組相比，PD98059+PDGF-

6、BB處理后miR-31表達水平顯著下降(P＜0.05)。
　　[結(jié)論]
　　1.組織貼壁法培養(yǎng)下肢動脈硬化閉塞癥患者VSMCs具有操作簡單、成熟可靠的特點。
　　2.ERK信號通路在PDGF-BB誘導的VSMCs增殖以及遷移中起重要作用。通過阻斷ERK通路可以顯著阻滯PDGF-BB誘導的VSMCs增殖以及遷移，促進VSMCs由增殖型向收縮型轉(zhuǎn)變，可能對動脈硬化的發(fā)生發(fā)展起抵抗作用。
　　3.在PDGF-BB誘導的