人類免疫缺陷病毒1型Tat蛋白的結(jié)構(gòu)改造及其顆粒性抗原的制備.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(HIV)感染及其引起的艾滋病，是我國及全球所面臨的重大公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害人類健康。開發(fā)研制安全有效的HIV疫苗以及抗HIV藥物是控制HIV感染及艾滋病流行的重要措施。
　　 HIV-1反式轉(zhuǎn)錄激活因子(trans-activator of transcription，Tat)是HIV-1在感染早期產(chǎn)生的一種重要調(diào)節(jié)蛋白，在病毒復(fù)制和感染致病中起重要作用。在HIV感染細(xì)胞內(nèi)，Tat可反式激活病毒基因組轉(zhuǎn)錄的起

2、始和延長，從而啟動和促進(jìn)病毒的復(fù)制。此外，分泌和釋放至細(xì)胞外的Tat還具有多樣的胞外活性，在艾滋病的免疫抑制、艾滋病腦病和Kaposi肉瘤形成等致病中發(fā)揮重要作用，被稱為“病毒毒素”，也使得Tat成為HIV疫苗研究的重要候選抗原之一。
　　 已有研究表明，盡管天然Tat蛋白的序列在HIV-1不同亞型毒株間具有高度的保守性，但其屬非折疊蛋白，結(jié)構(gòu)松散，使得天然Tat作為HIV疫苗的候選抗原尚存在誘發(fā)抗體尤其是免疫保護(hù)性抗體滴度低的

3、問題。因此，本研究根據(jù)天然HIV-1 Tat分子各功能區(qū)特點(diǎn)及其親疏水性分析，對HIV-1 Tat蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，原核表達(dá)多種截短的Tat突變體蛋白及其與HCV核心蛋白(HCVC)高疏水區(qū)122-191aa融合的重組抗原;分別用全長Tat及Tat突變體蛋白制備金標(biāo)體顆粒，免疫C57BL小鼠進(jìn)行免疫原性分析;嘗試用無細(xì)胞體外合成系統(tǒng)制備不同Tat突變體與HCVC122-191融合的重組抗原，并經(jīng)透射電鏡鑒定其顆粒性特征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為進(jìn)一

4、步研究HIV-1Tat生物學(xué)功能及制備安全有效的Tat顆粒性免疫原奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究分以下三個部分:
　　 第一部分HIV-1 Tat突變體與HCV核心蛋白融合重組抗原的原核表達(dá)HIV-1 Tat蛋白可分為6個功能區(qū):N端區(qū)(1-21aa)、半胱氨酸富集區(qū)(22-37aa)、核心區(qū)(38-47aa)、堿性氨基酸富集區(qū)(48-57aa)、谷氨酰胺富集區(qū)(58-72aa)以及C端區(qū)(73-101aa)）。在我們前期對T

5、at抗原結(jié)構(gòu)改造及免疫原性分析的基礎(chǔ)上，本研究結(jié)合對全長Tat蛋白親疏水性分析結(jié)果，首先構(gòu)建并原核表達(dá)了缺失Tat高疏水區(qū)(31-45aa)的HIV-1 HXB2株Tat突變體融合蛋白PET32a-Tat△(31-45)?；痉椒ê徒Y(jié)果如下:以質(zhì)粒pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)為模板，經(jīng)PCR和Overlap PCR獲得tat△(31-45)目的基因片段，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Tat△(31-45)，再

6、將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果獲得高表達(dá)的截短的Tat突變體融合蛋白PET32a-Tat△(31-45)，其相對分子量約為27，600，其表達(dá)量約占菌體總蛋白的55％，明顯高于全長Tat和其他Tat突變體蛋白的原核表達(dá)量。此外，本研究還利用本實(shí)驗(yàn)室前期正確構(gòu)建保存的不同HIV-1Tat重組表達(dá)質(zhì)粒（pET32a-Tat1-101，pET32a-Tat22-86，pET32a-Tat-22

7、-101, pPEPTIDE2-Tat1-21, pPEPTIDE2-Tat38-61和pPEPTIDE2-Tat60-101)，同上經(jīng)原核表達(dá)，分別獲得相對應(yīng)的全長Tat及其突變體融合蛋白，作為本研究中對照及檢測用蛋白;用Ni-NTA親和層析法純化上述目的融合蛋白。Western blot鑒定結(jié)果顯示，PET32a-Tat1-101和PET32a-Tat△(31-45)融合蛋白均與小鼠抗TatN末端單克隆抗體呈特異性反應(yīng)，而pET32

8、a載體蛋白則無此反應(yīng)。
　　 在此基礎(chǔ)上，選擇具有自我組裝功能的HCV核心蛋白(HCVC)高疏水區(qū)122-191aa為載體，制備不同Tat突變體與HCVC122-191融合的重組抗原。方法是經(jīng)PCR對編碼HCVC122-191基因進(jìn)行大腸桿菌喜愛密碼子優(yōu)化，以O(shè)verlapPCR將tat△(31-45)與HCVC(122-191) DNA片段拼接后，克隆至原核表達(dá)載體pPEPTIDE2中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pPEPTIDE2-

9、Tat△(31-45)-HCVC(122-191)。將該重組表達(dá)質(zhì)粒及本室前期構(gòu)建正確的2種Tat-HCVC重組質(zhì)粒(pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)和pPEP-Tat22-86-HCVC(122-191))轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)中，經(jīng)常規(guī)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)（37℃誘導(dǎo)3.5h），用12％ SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結(jié)果未獲得目的表達(dá)條帶。隨后用低溫長時間IPTG誘導(dǎo)方法，即在30℃條件下，在表達(dá)菌

10、株E.coliBL21(DE3)中，分別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)10 h表達(dá)3種Tat-HCVC重組原核表達(dá)質(zhì)粒(pPEP-Tat△(31-45)-HCVC(122-191), pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)和pPEP-Tat22-86-HCVC(122-191))，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12％ SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結(jié)果仍未觀察到HIV-1 Tat-HCVC122-191重組蛋白表達(dá)條帶，未獲得預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　

11、第二部分HIV-1 Tat及其突變體蛋白的金標(biāo)體顆粒制備與免疫原性分析為解決第一部分中HIV-1 Tat-HCVC122-191融合重組抗原經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)未得到預(yù)期陽性結(jié)果的問題，本研究同時進(jìn)行了Tat及其突變體金標(biāo)體顆粒的制備（第二部分）以及用無細(xì)胞體外合成系統(tǒng)表達(dá)Tat-HCVC122-191融合顆粒性抗原（第三部分）。第二部分研究首先用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，經(jīng)分光光度計(jì)和透射電鏡檢測鑒定，獲得分散度和均一度均較好的兩種金

12、顆粒(平均顆粒大小分別約75.5 nm和32.5 nm)。將Tat及3種Tat突變體融合蛋白(PET32a-Tat△(31-45)、PET32a-Tat22-101和PET32a-Tat22-86）分別標(biāo)記75.5nm膠體金顆粒，用NaC1聚沉實(shí)驗(yàn)檢測在不同pH條件下Tat及其突變體蛋白金標(biāo)體復(fù)合物的穩(wěn)定性;分別用上述Tat蛋白及其金標(biāo)體復(fù)合物免疫C57/BL小鼠，制備小鼠抗血清，經(jīng)ELISA方法檢測小鼠免疫抗血清抗體滴度以及與Tat不

13、同肽段的反應(yīng)性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，全長Tat1-101和Tat△(31-45)蛋白金標(biāo)體溶液分別在pH5.5～9.5、pH5.5～11.0范圍內(nèi)較好地保持其穩(wěn)定性，Tat22-101和Tat22-86蛋白金標(biāo)體溶液分別在pH4.0～9.5、pH4.5—9.5較好地保持其穩(wěn)定性。ELISA檢測結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)組均能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗全長Tat免疫抗血清，其中Tat1-101金標(biāo)體組抗Tat小鼠抗血清滴度最高(1，024，000)，顯

14、著高于Tat1-101蛋白組和其他免疫組;當(dāng)Tat△(31-45)標(biāo)記膠體金后其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗Tat抗體滴度明顯提高，表明膠體金標(biāo)記對全長Tat和Tat△(31-45)突變體蛋白免疫原性的增強(qiáng)作用明顯。
　　 表位分析結(jié)果顯示，全長Tat1-101蛋白標(biāo)記膠體金后的免疫反應(yīng)增強(qiáng)作用，主要是誘導(dǎo)產(chǎn)生抗TatN端表位的抗體;抗Tat22-86蛋白和抗Tat22-86金標(biāo)體兩者小鼠抗血清與Tat38-61和Tat60-101的反應(yīng)性達(dá)到

15、抗全長Tat小鼠抗血清水平;抗Tat22-101金標(biāo)體小鼠抗血清與Tat C末端60-101aa的反應(yīng)性明顯增強(qiáng)，明顯高于抗全長Tat抗血清與Tat60-101的反應(yīng)性;抗Tat△(31-45)金標(biāo)體小鼠抗血清與Tat1-21、Tat38-61和Tat60-101三個肽段的結(jié)合作用均顯著增強(qiáng)，也達(dá)到抗全長Tat或抗全長Tat金標(biāo)體抗血清水平。上述結(jié)果表明，本研究制備的3種Tat突變體融合蛋白(Tat22-101、Tat22-86和Tat

16、△(31-45))金標(biāo)體顆粒均較好地保留了免疫原性，且可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對Tat不同功能區(qū)表位的抗體，為聯(lián)合應(yīng)用Tat表位抗原制備新型HIV Tat疫苗奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第三部分HIV-1 Tat突變體與HCVC122-191融合顆粒性抗原的無細(xì)胞體外表達(dá)與鑒定該部分嘗試用無細(xì)胞體外合成系統(tǒng)表達(dá)Tat及其突變體與HCVC122-191融合的顆粒性抗原。方法是用Overlap PCR將tat1-101、tat1-86、tat22-1

17、01、tat22-86和tat△(31-45)分別與HCVC122-191 DN△片段進(jìn)行拼接，經(jīng)NcoI和BamHI雙酶切及序列測定正確后，分別克隆至大腸桿菌無細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pIVEX2.4d中，構(gòu)建5種重組無細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒(pIVEX2.4d-Tat1-101-HCVC122-191、pIVEX2.4d-Tat1-86HCVC122-191、 pIVEX2.4d-Tat22-101-HCVC122-191、pIVEX2.4d-Tat22

18、-86-HCVC122-191和pIVEX2.4d-Tat△(31-45)-HCVC(122-191),用基于大腸桿菌細(xì)胞裂解液的無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)，經(jīng)12％SDS-PAGE和Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，用透射電鏡檢測表達(dá)的HIV-1Tat-HCVC122-191重組蛋白的顆粒性特征。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種Tat-HCVC重組蛋白（Tat22-100-HCVC122-191和Tat22-86-HC

19、VC122-191）表達(dá)產(chǎn)物出現(xiàn)表達(dá)條帶，分子量大小分別約16.10 kDa和14.35 kDa，與理論值相符。Western blot鑒定結(jié)果顯示，Tat22-101-HCVC122-191和Tat22-86-HCVC122-191融合蛋白均與小鼠抗Tat單克隆抗體(Anti-HIV-1 Tatantibody(71-81))呈陽性特異性結(jié)合反應(yīng)。負(fù)染法透射電鏡檢測結(jié)果表明，2種Tat-HCVC重組蛋白（Tat22-101-HCVC1

20、22-191和Tat22-86-HCVC122-191）均具有明顯顆粒性特征，直徑大小分別約175±30mm和188±39nm，而對照組蛋白（Tat22-86和Tat22-101）未見顆粒樣結(jié)構(gòu)，表明高疏水性HCVC122-191保持了良好的自組裝功能，Tat突變體蛋白與之融合后可形成新型Tat顆粒性抗原。
　　 總結(jié):
　　 1.成功構(gòu)建缺失HIV-1 Tat高疏水區(qū)31-45aa的Tat突變體原核表達(dá)質(zhì)粒，并獲得高表

21、達(dá)的Tat突變體重組蛋白PET32a-Tat△(31-45)，提示Tat高疏水區(qū)31-45aa對HIV-1 Tat及Tat突變體蛋白的表達(dá)有一定的抑制作用。
　　 2.經(jīng)酶切鑒定和序列測定證實(shí)構(gòu)建正確的3種Tat與HCV核心蛋白(HCVC)高疏水區(qū)（122-191aa）DNA序列重組的原核表達(dá)質(zhì)粒(pPEPTIDE2-Tat△(31-45)-HCVC(122-191)、pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)和pP

22、EP-Tat22-86-HCVC(122-191))轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)菌株中，用常規(guī)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)（37℃誘導(dǎo)3.5 h）和低溫長時間IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(30℃誘導(dǎo)10h)均未觀察到目的表達(dá)條帶，未獲得預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 3.膠體金標(biāo)記對全長Tat和Tat△(31-45)突變體蛋白免疫原性有明顯增強(qiáng)作用;制備的3種Tat突變體融合蛋白(PET32a-Tat△(31-45)、PET32a-Tat22-101和P

23、ET32a-Tat22-86)金標(biāo)體顆粒均保留了較好的免疫原性，其中抗Tat△(31-45)金標(biāo)體小鼠抗血清與三個Tat肽段（Tat1-21、Tat38-61和Tat60-101）的結(jié)合作用均顯著增強(qiáng)，達(dá)到抗全長Tat蛋白或抗全長Tat金標(biāo)體小鼠抗血清水平;抗Tat22-86金標(biāo)體小鼠抗血清與Tat38-61和Tat60-101的反應(yīng)性也達(dá)到抗全長Tat小鼠抗血清水平;而抗Tat22-101金標(biāo)體小鼠抗血清與Tat C末端60-101a

24、a的反應(yīng)性則明顯高于抗全長Tat抗血清與Tat60-101的反應(yīng)性，表明本研究制備的Tat突變體蛋白金標(biāo)體顆?？烧T導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的針對Tat不同功能區(qū)表位的抗體，有可能具有阻斷天然Tat蛋白的反式轉(zhuǎn)錄激活等生物學(xué)活性的作用。
　　 4.構(gòu)建5種HIV-1Tat-HCVC122-191重組無細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒(pIVEX2.4d-Tat(1-101)-HCVC(122-191), pIVEX2.4d-Tat(1-86)-HCVC(122-1

25、91),pIVEX2.4d-Tat(22-101)-HCVC(122-191), pIVEX2.4d-Tat(22-86)-HCVC(122-191)和pIVEX2.4d-Tat△(31-45)-HCVC(122-191)，經(jīng)無細(xì)胞合成系統(tǒng)表達(dá)，成功獲得兩種以HCVC122-191為疏水核心的納米級新型Tat突變體顆粒性抗原(Tat(22-86)-HCVC(122-191)和Tat(22-101)-HCVC(122-191))，實(shí)驗(yàn)結(jié)果