PRRSV-GSWW-2015株病毒特征分析與重組病毒拯救技術(shù)體系建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的,以母豬繁殖障礙和各年齡豬呼吸困難為特征的疫病。2006年，我國爆發(fā)高致病性PRRS（HP-PRRS），對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，其危害一直持續(xù)至今。2015年甘肅武威某豬場發(fā)生典型的PRRS癥狀，對采集的病料進(jìn)行了病毒分離與鑒定。通過Marc-145細(xì)胞分離病毒，RT-PCR和N蛋白間接免疫熒光檢測確定為PRRSV感染陽性。隨后測定了PRRSV GSW

2、W株全基因組序列，并與國內(nèi)外參考毒株比對分析。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，GSWW株屬于第Ⅲ亞群，于 nsp2編碼區(qū)存在30個氨基酸的不連續(xù)缺失。GP5蛋白主要中和抗原表位氨基酸突變，中和表位附近出現(xiàn)新的糖基化位點 N34。因此， GSWW分離株是我國流行的高致病性毒株。
　　為了進(jìn)一步研究 GSWW分離株的致病性和免疫學(xué)特性，選取了24頭PRRSV陰性豬進(jìn)行感染試驗，其中17頭以108拷貝數(shù)病毒量鼻腔攻毒，7頭進(jìn)行同居感染。攻毒與同居感染

3、豬于感染后5天逐漸出現(xiàn)了發(fā)熱，沉郁，消瘦等癥狀，嚴(yán)重的出現(xiàn)耳朵發(fā)紺、呼吸困難甚至死亡。感染后兩個月共死亡10頭豬，均出現(xiàn)了高水平的病毒血癥，解剖發(fā)現(xiàn)肺臟病變出血，淋巴結(jié)出血，扁桃體腫大等病變。熒光定量 PCR檢測血液中病毒含量，實驗動物最早在攻毒后4天出現(xiàn)病毒血癥，病毒血癥可持續(xù)超過一個月，血液中病毒含量可達(dá)108 copies/mL。通過間接ELISA方法檢測N蛋白抗體，感染后7天出現(xiàn)N蛋白抗體陽性，但均未檢測到γ干擾素應(yīng)答。因此，G

4、SWW分離株為PRRSV強毒株，具有較高的致病性和致死率。
　　由于PRRSV高度變異且保護性免疫應(yīng)答水平較低，目前還沒有非常安全有效的疫苗，如何提高疫苗的免疫效果一直是研究的熱點。研究表明，PRRSV基因組中存在復(fù)制非必需區(qū)，允許插入外源基因片段，因而可以作為疫苗載體表達(dá)外源基因。本研究利用北美PRRSV Fl12感染性克隆，在病毒基因組ORF1b和ORF2a之間插入獨立的轉(zhuǎn)錄單位，表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）。通過Poly（A

5、）末端的AclⅠ酶切位點將重組質(zhì)粒線性化，體外轉(zhuǎn)錄得到病毒全長RNA，然后電轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞包裝產(chǎn)生重組病毒，在Marc-145細(xì)胞傳代增殖。重組病毒vFl12-EGFP可正確表達(dá)EGFP，Marc-145細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變和綠色熒光，但是在Marc-145上傳代不穩(wěn)定，第三代病毒丟失了EGFP基因；然而在豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）上連傳七代均穩(wěn)定表達(dá)EGFP。隨后，采用相同的策略構(gòu)建了表達(dá)口蹄疫病毒（FMDV）B7多表位基因的重