Neuritin對Neuralized介導(dǎo)的Notch信號途徑的影響.pdf

1、目的：觀察Neuritin過表達(dá)對Neuralized和Neuralized介導(dǎo)的Notch信號通路的影響，明確Neuritin與Neuralized介導(dǎo)的Notch信號通路的關(guān)系，探討Neuritin在調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，分化和增殖中的作用機(jī)制。 方法： （1）運(yùn)剛免疫共沉淀技術(shù)（immunoprecipitation，IP）驗(yàn)證Neuritin與Neuralized之間的相互作用 ①構(gòu)建pcDNA3.

2、1-his/myc-neuritin質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-neuralized質(zhì)粒； ②利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將上述真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞； ③采用免疫共沉淀技術(shù)（正向和反向）檢測上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Neuritin和Neuralized的相互作用。 （2）利用真核表達(dá)技術(shù)，觀察Neuritin過表達(dá)對Neuralized介導(dǎo)的Notch信號通路的影響 ①構(gòu)建pEGFP-C1-JAG1-TB熒

3、光表達(dá)載體； ②利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pIRES-HA-Jag1或pEGFP-C1-JAG1-TB質(zhì)粒，bpcDNA3.1-flag-neuralized質(zhì)粒，pcDNA3.1-his-neuritin質(zhì)粒，分組轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞； ③用western-blot技術(shù)檢測三組細(xì)胞中Neuritin，Neuralized和JAG1的表達(dá)情況； ④利用細(xì)胞內(nèi)定位技術(shù)觀察三組細(xì)胞中Neuritin蛋白對JAG1-TB蛋白

4、內(nèi)吞的影響。 結(jié)果： （1）Neurtitin蛋白和Neuralized蛋白免疫共沉淀檢測結(jié)果顯示：細(xì)胞內(nèi)Neuritin蛋白可Neuralized蛋白發(fā)生相互作用； （2）利用western-blot技術(shù)檢測Neuritin蛋白對Neuralized介導(dǎo)的Notch配體蛋白JAG1表達(dá)水平的影響結(jié)果顯示：Neuritin蛋白能夠抑制Neuralized蛋白介導(dǎo)的JAG1蛋白表達(dá)下調(diào)； （3）利用細(xì)胞內(nèi)定

5、位技術(shù)觀察三組細(xì)胞中Neuritin對Neuralized介導(dǎo)的JAG1內(nèi)吞的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Neuritin蛋白可以部分的抑制JAG1蛋白的內(nèi)吞。 結(jié)論： （1）Neuritin蛋白能夠與Neuralized蛋白相互作用； （2）Neuritin蛋白能夠抑制Neuralized蛋白介導(dǎo)的JAG1蛋白表達(dá)下調(diào)； （3）Neuritin蛋白能夠部分抑制Neuralized蛋白介導(dǎo)的JAG1-TB蛋白內(nèi)吞