Smad-c-Jun氨基末端激酶與尿道下裂發(fā)生相關(guān)性和調(diào)控機制研究.pdf

1、目的:尿道下裂(hypospadias)是一種常見的泌尿生殖系統(tǒng)畸形，在不同種族，新生兒發(fā)病率大約在1/(200～300)，并呈逐年上升趨勢。目前手術(shù)矯治是其唯一的治療方法，但是，任何一種矯治方式均會伴有顯著的并發(fā)癥以及造成患兒可能的精神心理陰影。為此，本研究擬從尿道下裂患者和尿道下裂動物實驗研究兩個方面來探討Smad和JNK信號與尿道下裂發(fā)生的相關(guān)性和調(diào)控機制;為進一步防治尿道下裂奠定科學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.臨床研

2、究:收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院泌尿外科病房行尿道修復(fù)術(shù)尿道下裂患兒（32例）術(shù)中切除的包皮組織，分為輕中型尿道下裂組（16例），重型尿道下裂組（16例）。同時設(shè)立正常對照組:為我院泌尿外科門診行包皮環(huán)切術(shù)兒童（32例）術(shù)中切除的包皮組織，各組取材均為陰莖遠端包皮組織，尿道下裂輕中型組、重型組與正常對照組年齡匹配。分別應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(q-PCR)、免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡法（western blotting）檢測各組包皮組

3、織中Smad和JNK信號的表達水平。
　　2.動物實驗研究
　　1).建立尿道下裂動物模型:SD孕鼠40只，完全隨機分成4組:大豆油對照組和鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯[di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]低、中、高3個劑量組（分別為500，750和1000mg/kg bw/day）。在懷孕天數(shù)(gestation day, GD)第12～19天連續(xù)灌胃，對出生后(postnatal day,

4、PND)不同日齡(PND1/8/16/20/30)仔鼠進行計數(shù)、稱量體重和測量肛門生殖器距離（anogenital distance，AGD）;PND30測量陰莖長度，判斷有無尿道下裂。
　　2).同樣的SD孕鼠20只，完全隨機分成2組:大豆油對照組和上一部分實驗得知的適宜建模的DEHP灌胃劑量組，于孕鼠GD20日齡，行手術(shù)剖宮產(chǎn)取胎鼠，切取胎鼠陰莖組織，分別應(yīng)用q-PCR、免疫組織化學(xué)和western blotting方法檢測各

5、組陰莖組織中Smad和JNK信號的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.相對于正常對照包皮組織，尿道下裂患者包皮組織中Smad7、Smad3和Smad2 mRNA的表達分別升高97.0％，22.8％和59.9％;且均有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05); JNK1 mRNA和JNK1/2磷酸化蛋白在輕中型和重型尿道下裂患者包皮組織中的表達較正常水平亦顯著增高（均P＜0.05），JNK2磷酸化蛋白水平在重型尿道下裂患者的表達顯著高于輕

6、中型患者(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)分析顯示Smad7、磷酸化Smad2/3和磷酸化JNK1/2蛋白在尿道下裂包皮組織中表達均有增高趨勢，且主要分布于包皮下的間充質(zhì)細胞層。
　　2.與大豆油對照組相比，隨著DEHP暴露劑量增大，每窩產(chǎn)活仔數(shù)及雄性活仔數(shù)均有顯著減少(P＜0.05);母鼠孕期明顯延長，難產(chǎn)、死胎數(shù)增加;仔鼠體重減輕、AGD、體重/AGD和陰莖長度明顯縮短(P＜0.05)。DEHP低中高劑量組誘導(dǎo)出雄性仔鼠尿道下裂發(fā)

7、生率分別為10.7％，30.6％和37.0％，且可分類出輕型、中型和重型尿道下裂大鼠類型，其中重型尿道下裂在三個劑量組的發(fā)生率分別為0％，8.3％和22.2％，各劑量組間差異顯著(P＜0.05);得出較適宜的DEHP誘導(dǎo)建模劑量為750 mg/kg bw/day。
　　3.DEHP孕期暴露后，胎鼠體重、AGD及其比值較正常大豆油對照明顯減輕或縮短(P＜0.05);胎鼠陰莖組織中Smad7、Smad3和Smad2mRNA表達較正常對

8、照組分別升高87.0％、61.9％和30.7％，均有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Smad7和p-Smad2/3蛋白在DEHP暴露后胎鼠陰莖組織中表達豐富，而在正常對照組無表達。DEHP暴露組胎鼠陰莖組織中JNK1/2 mRNA和p-JNK1/2蛋白表達水平較正常對照顯著上調(diào)(P＜0.05)，但是T-JNK蛋白在兩組之間的表達水平無明顯差異。
　　結(jié)論:DEHP孕期暴露誘導(dǎo)出大鼠類似于人類的尿道下裂發(fā)生。S