2665.牛腸激酶輕鏈在畢赤酵母中的表達(dá)及熱穩(wěn)定性改造

1、牛腸激酶牛腸激酶輕鏈輕鏈在畢赤酵母中的表達(dá)在畢赤酵母中的表達(dá)及熱穩(wěn)定性改造及熱穩(wěn)定性改造ProductionEngineeringThermostabilityofBovineEnterokinaselightchain(BEKL)inPichiapastis學(xué)科專業(yè)：生物工程研究生：郭超指導(dǎo)教師：甘一如教授企業(yè)導(dǎo)師：王大梅教授級(jí)高工天津大學(xué)化工學(xué)院二零一六年五月摘要摘要腸激酶（EnterokinaseEK）是存在于哺乳動(dòng)物十二指腸內(nèi)的

2、一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶。由于其酶切的高度特異性，酶解后可保證目的蛋白N末端氨基酸序列的完整性，從而使得腸激酶成為基因工程領(lǐng)域融合蛋白表達(dá)后修飾的首選工具酶之一。本研究通過(guò)基因工程手段，成功構(gòu)建了重組牛腸激酶載體pPIC9KBEKL。經(jīng)G418抗性梯度篩選獲得了5株不同抗性水平的菌株并借助QPCR技術(shù)，對(duì)其基因拷貝數(shù)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示菌株抗性水平及腸激酶表達(dá)量與外源基因拷貝數(shù)呈正相關(guān)。隨后，采用多因素優(yōu)選法對(duì)篩選所得的菌株進(jìn)行了表達(dá)

3、條件優(yōu)化，并利用鎳離子親和層析的方法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。結(jié)果顯示，經(jīng)畢赤酵母表達(dá)所得的重組型牛腸激酶分子量約為43kDa，糖基化程度約為20.9%。純化后，每1L發(fā)酵液獲得5.7mg具有活性的目的蛋白，采用切割融合蛋白的方法測(cè)定純化后牛腸激酶的比活達(dá)1.25103Umg，動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km=0.59mM，kcat=45.1S1。以牛腸激酶輕鏈作為研究對(duì)象，嘗試?yán)美硇栽O(shè)計(jì)的方法以提高其熱穩(wěn)定性。首先綜合Gromas4.5.5、BFact

4、及FlexService等不同考評(píng)蛋白柔性區(qū)軟件的分析結(jié)果，確定出腸激酶的結(jié)構(gòu)靈活區(qū)Fragment6369，F(xiàn)ragment8593及Fragment135139，并通過(guò)添加脯氨酸或二硫鍵的方法來(lái)對(duì)蛋白的靈活區(qū)進(jìn)行剛化。根據(jù)β轉(zhuǎn)角內(nèi)序列統(tǒng)計(jì)信息及引入位置原有的殘基不參與形成氫鍵的原則確定了三株脯氨酸突變體S67P，R87P及Y136P。結(jié)合腸激酶結(jié)構(gòu)信息及DisulfidebyDesign軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，確定了三株添加二硫鍵突變體：C5

5、C146，C85C88及C73C98。利用Quickchange定點(diǎn)突變的方法引入突變位點(diǎn)，并通過(guò)在畢赤酵母中表達(dá)成功獲得了6種不同突變體蛋白。在對(duì)野生型及突變型牛腸激酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，添加二硫鍵后的突變體（C5C146，C85C88及C73C98）及脯氨酸突變體（R87P），其失活半衰期（t12）和半失活溫度（T5010）較野生型均有了顯著提高。同時(shí)，對(duì)R87P及C85C88突變體酶活測(cè)定結(jié)果表明，突變體酶催化效率（Kmkcat