抗細(xì)菌FabB蛋白單克隆抗體的制備及FabB在不同菌種中的分布和差異研究.pdf

1、細(xì)菌脂肪酸的合成屬于Ⅱ型脂肪酸合成酶系，與高等哺乳動物的Ⅰ型脂肪酸合成酶系有差別，Ⅱ型脂肪酸合成酶系的每一步催化反應(yīng)都是由獨(dú)立的酶完成的。大腸桿菌的脂肪酸合成由FabB、FabF、FabH、FabG、FabZ和FabA等酶來完成，F(xiàn)abB和FabF有縮合丙二酸單酰ACP與脂酰ACP的功能，從而完成碳鏈的延伸。大腸桿菌合成不飽和脂肪酸需要FabB蛋白的參與，催化不飽和脂酰ACP的從頭合成，產(chǎn)生順-9-十六烯脂酰ACP。還有研究表明，F(xiàn)ab

2、B和FabF在細(xì)菌應(yīng)對外界溫度改變時發(fā)揮作用，這與細(xì)菌細(xì)胞膜的流動性相關(guān)。細(xì)菌脂肪酸合成存在多樣性，這也為針對病原細(xì)菌篩選專一性的抗菌藥物提供了可能。
　　本研究根據(jù)GenBank上已發(fā)表的大腸桿菌fabB基因序列設(shè)計針對FabB蛋白全長的特異性引物，PCR擴(kuò)增鵝源大腸桿菌G8107株fabB基因，獲得大小正確的目的片段，克隆到pET-32a(+)表達(dá)載體中，經(jīng)酶切鑒定，測序分析，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-fabB，轉(zhuǎn)化入大腸桿

3、菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌在28℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時，經(jīng)過SDS-PAGE分析證明，含重組質(zhì)粒的重組菌能夠表達(dá)分子量為62KD左右的融合蛋白。表達(dá)產(chǎn)物通過鎳柱純化后得到純度很高的目的蛋白。這為我們制備抗FabB單克隆抗體提供了很好的基礎(chǔ)。
　　取純化的融合蛋白His-FabB免疫BALB/c小鼠，在檢測到小鼠已產(chǎn)生針對FabB融合蛋白的陽性血清后，進(jìn)行細(xì)胞融合，細(xì)胞培養(yǎng)一定時間后包被融合蛋白和His標(biāo)簽

4、蛋白來進(jìn)行篩選，篩選出能產(chǎn)生針對融合蛋白而非標(biāo)簽蛋白的抗體的細(xì)胞培養(yǎng)孔，進(jìn)行亞克隆，最后得到4株抗大腸桿菌FabB蛋白的IgG1單克隆抗體，并用這4株雜交瘤細(xì)胞制備腹水。單克隆抗體可以特異性地識別FabB蛋白，這為我們后續(xù)進(jìn)行不同種屬細(xì)菌中FabB蛋白的檢測奠定了基礎(chǔ)。
　　根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦弥苽浜玫膯慰寺】贵w檢測不同種屬細(xì)菌是否存在FabB蛋白，首先用Western-blot的方法檢測到一些常見細(xì)菌中含有該蛋白，然后用PCR的

5、方法驗(yàn)證，最后間接免疫熒光檢測都得到同樣的結(jié)果，也驗(yàn)證了FabB存在于細(xì)胞質(zhì)中。通過測序和GenBank上下載fabB基因序列比較不同種屬細(xì)菌該蛋白的序列差異和同源性，分析它們之間的異同。結(jié)果顯示大腸桿菌（埃希氏菌屬）、沙門氏菌、檸檬酸桿菌、克雷伯桿菌、志賀氏菌、腸桿菌（腸桿菌屬）和耶爾森菌含有FabB蛋白且同源性相近，雖然序列上仍存在一些差異但活性位點(diǎn)都相似。這些細(xì)菌都屬于腸桿菌科，這也許和腸桿菌科細(xì)菌的生長特點(diǎn)有關(guān)系。
　　為

6、研究FabB對細(xì)菌是否發(fā)揮關(guān)鍵作用以及為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，應(yīng)用Red/ET同源重組技術(shù)對目的基因fabB進(jìn)行敲除，同時以敲除ompA基因作為對照。根據(jù)大腸桿菌fabB基因、ompA基因和FRT-flanked PGK-gb2-neo cassette卡那霉素抗性片段設(shè)計兩對含50bp同源臂的引物分別擴(kuò)增該片段。利用電轉(zhuǎn)化的方法先后將pRedET質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增的含同源臂的抗性片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌G8107感受態(tài)細(xì)胞，pRedET質(zhì)粒能表達(dá)重