GBSSIP-glgC嵌合基因馬鈴薯體內(nèi)表達(dá)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因植物的出現(xiàn)為改良和選育出高產(chǎn)作物品種開辟了一條新的道路，其中利用基因轉(zhuǎn)化改良淀粉品質(zhì)是植物轉(zhuǎn)基因研究的熱點(diǎn)之一。馬鈴薯塊莖淀粉因其直鏈和支鏈分子多聚度高，淀粉粒大小差異大等原因其水溶液的粘度高于玉米和小麥，因而被廣泛應(yīng)用于紡織，建筑，石油開采等領(lǐng)域，但其淀粉含量低已成為了限制淀粉加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。
　　 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)在細(xì)菌和高等植物

2、中催化磷酸葡萄糖和PPi反應(yīng)生成糖原或淀粉生物底物ADP-葡萄糖，該反應(yīng)是淀粉生物合成的限速酶；研究顯示，植物AGPase對(duì)晝夜周期調(diào)控敏感，在玉米中表達(dá)大腸桿菌編碼AGPase的glgC基因，可提高其淀粉合成量。
　　 為了通過(guò)提高AGPase活性增加塊莖淀粉含量，同時(shí)相對(duì)提高支鏈淀粉含量，本實(shí)驗(yàn)室用大腸桿菌glgC、馬鈴薯GBSSIcDNA及其啟動(dòng)子構(gòu)建了重組融合基因的植物轉(zhuǎn)化載體pCB1，pCB2，pC-g和pC-gpg，

3、但其馬鈴薯體內(nèi)表達(dá)尚未完成。
　　 本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，將目的重組基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯體內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯抗性苗93株。抗性苗經(jīng)過(guò)PCR的檢測(cè)，獲得33株陽(yáng)性結(jié)果。PCR檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子的莖段進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，GUS基因在12株轉(zhuǎn)化子的莖段中得到表達(dá)。
　　 以GUS染色陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板，以地高辛標(biāo)記的glgC基因的PCR產(chǎn)物為探針做Southern雜交，結(jié)果得到了不同轉(zhuǎn)化子基因組中

4、重組基因插入拷貝數(shù)，其中單拷貝轉(zhuǎn)化子9株，雙拷貝轉(zhuǎn)化子2株，多拷貝轉(zhuǎn)化子1株。
　　 12株轉(zhuǎn)化子AGPase酶活力以及淀粉含量測(cè)定及分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子DXY-pCB2-2的AGPse酶活力顯著高于對(duì)照及其它轉(zhuǎn)化子，DXY-pCB1-2淀粉含量顯著高于對(duì)照及其它轉(zhuǎn)化子，研究初步確定了高淀粉和高酶活力的轉(zhuǎn)化子，為進(jìn)一步的篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　 相關(guān)分析表明GUS陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子AGPase活力和淀粉含量相關(guān)不顯著，其中重組基因

5、單拷貝插入轉(zhuǎn)化子ZHB-PCB1-1，DXY-PCB1-2，DXY-PCB2-1，DXY-PCB2-2的AGPase活力和淀粉含量顯著高于對(duì)照及其它轉(zhuǎn)化子，室外條件下確認(rèn)其AGPase活力和淀粉含量后，可作為進(jìn)一步淀粉改良的種質(zhì)。
　　 最后，本研究建立了熒光發(fā)光反應(yīng)測(cè)定ADP-葡萄糖焦磷酸酶活力方法，克服了傳統(tǒng)的32p同位素方法的操作步驟繁瑣，耗時(shí)較多，易污染等不足。盡管所建立方法經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其準(zhǔn)確性，但在以后應(yīng)用前需與傳