人心房肌細(xì)胞pshrnakir2.1重組體的構(gòu)建與鑒定及人心房肌細(xì)胞總rna與才cdna的獲取

1、Y 7 8 4 0 4 5中圖分類號：R 3 4 9 ．3瀘糾蜃爹陀研究生碩士學(xué)位論文人心房肌細(xì)胞P s h R N A —K i r 2 ．1 重組體的構(gòu)建與鑒定及人心房肌細(xì)胞總R N A 與才c D N A 的獲取研究生姓名 趙 磊學(xué)科、專業(yè) 生 壅 堂導(dǎo)師姓名 ．曾曉苤 救援二0 0 五年五月室溫離心1 分鐘；重復(fù)上一次步驟一次；取下濾過柱，倒掉收集管中的廢液，將濾過柱放入同一個收集管中，1 2 0 0 0 轉(zhuǎn)每分鐘室溫離心1 分

2、鐘；將濾過柱放入一根新的1 ．5 m l 離心管中，在柱子膜中央加3 0 u l 雙蒸水，室溫或3 7 度孵育2 分鐘；1 2 0 0 0 轉(zhuǎn)每分鐘室溫離心1 分鐘，離心管中的液體即為回收的D N A 片段。將酶切后的P t z u 6 + l 載體與退火后的雙鏈s h R N A序列相連：將酶切后的載體中加入插入片段，T 4 D N A 連接酶，連接酶緩沖液，去離子水等，放入4 度冰箱連接過夜。然后將連接產(chǎn)物放入7 2 度水浴中1 0

3、 分鐘，以滅活連接酶。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌中。感受態(tài)大腸桿菌的制備過程：吸取1 0 0 u l 過夜搖的D H 5a 大腸桿菌放入1 5 m l L B 培養(yǎng)液內(nèi)，放入3 7 度恒溫?fù)u床內(nèi)，2 0 0 轉(zhuǎn)每分鐘，4 個小時；觀察菌液混濁，將其分裝在三個預(yù)冷的5 m l 離心管內(nèi)，冰浴1 0 分鐘：4 度，5 0 0 0 轉(zhuǎn)每分鐘，離心1 0 分鐘；棄上清，加入l m l 0 ．1 m o l ／L 預(yù)冷的氯化鈣，冰浴2 0

4、 分鐘；4 度，5 0 0 0 轉(zhuǎn)每分鐘，離心1 0 分鐘；棄上清，每管加入2 0 0 u l預(yù)冷的0 ．1 m o l ／L 氯化鈣，分裝，裝在三個1 ．5 m l 離心管中，每管1 0 0 u l ，放入4 度冰箱4 個小時。轉(zhuǎn)化過程如下： 在已制備好的感受態(tài)細(xì)菌中分別加入不同的D N A ，1 號加入連接產(chǎn)物，對照一進僅加入雙鏈D N A 片段，對照二加入P t z u 6 + 1 ；將三只管放入冰水浴中3 0 分鐘； 每管一齊放

5、入4 2 度水浴中熱休克2 分鐘，切勿搖動，迅速放置于冰水浴中；每管中加入預(yù)溫的L B 培養(yǎng)液8 0 0 u l ，3 7 度，2 0 0 轉(zhuǎn)每分鐘恒溫?fù)u床中振蕩1 小時；分別取菌液2 0 0 u l ，涂布于3 個含氨芐青霉素的培養(yǎng)皿上，放入3 7 度恒溫箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)1 2 小時后，在培養(yǎng)皿上隨機挑取兒個克隆，進行搖菌培養(yǎng)，培養(yǎng)1 2 至1 6 個小時后，按上述方法，重新提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行E c o R l與H i n d 3

6、 酶切，并且電泳鑒定，并交由博亞生物公司測序鑒定。2 、人心房肌細(xì)胞總R N A 的提取，及逆轉(zhuǎn)錄成e D N A 。按T r i z o l R e a g e n t 的操作說明提取人心房肌細(xì)胞的總R N A 。將所有用來提取R N A 的器械用D E P C處理，預(yù)先準(zhǔn)備好所需的除T r i z o l R e a g e n t 以外的所有試劑。如氯仿，異丙醇等。人心房肌細(xì)胞總R N A 的提取步驟：將所取心房肌標(biāo)本稱重；按10

7、 0 m g 心?。痩 m l T r i ．r e a g e n t 的比例，將心房肌與T r i ．r e a g e n t 混合勻漿；在勻漿液中加入氯仿，劇烈振蕩后，室溫靜置1 0 分鐘；4 度離心1 2 0 0 0 轉(zhuǎn)l o分鐘；可見離心管內(nèi)的液體分為三相，小心取出上層水相于另一個新的離心管內(nèi)；在新離心管內(nèi)加入異丙醇，劇烈振蕩后，室溫靜置1 0 分鐘：4 度離心1 2 0 0 0 轉(zhuǎn)1 0 分鐘；棄上清，加入7 5 ％的乙醇