宿主分子TXNIP影響HCV復制的分子機制研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV，hepatitis C virus)感染可影響宿主細胞信號的傳導、改變細胞基因的表達，宿主基因表達的變化可能影響病毒的感染或參與病毒的致病。本課題通過表達譜基因芯片分析，找出了一個在HCV感染后表達上調(diào)的細胞分子:硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP，thioredoxin-interactingprotein)，并發(fā)現(xiàn)敲低Huh7細胞中TXNIP的表達會抑制J6/JFH1株HCVcc的感染。進一步對TXNIP進行深入研

2、究，驗證其差異表達，探討其對HCV感染的影響:1、HCV通過什么機制誘導TXNIP上調(diào);2、TXNP在HCV的生命周期中發(fā)揮什么作用;3、HCV感染誘導的TXNIP上調(diào)是否參與到HCV的致病過程。希望通過研究，揭示宿主分子TXNIP與HCV相互作用的分子機制，探討TXNIP分子對HCV感染與致病的影響。
　　本文主要結果及結論如下:
　　（一）HCV感染誘導Huh7細胞系表達譜變化，宿主分子TXNIP轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)
　　

3、利用MOI=1的HCVcc感染Huh7細胞，感染72 h以后用抽提感染細胞以及對照組細胞的總RNA，樣品送生物技術技術公司進行Glue Grant Human TranscriptomeArray基因芯片分析，比較HCVcc感染前后的Huh7細胞轉(zhuǎn)錄組差異。發(fā)現(xiàn)了871個顯著上調(diào)基因（上調(diào)≥1.5倍），765個下調(diào)基因（下調(diào)≤0.66倍）;2339個上調(diào)顯著的非編碼RNA，2479個下調(diào)顯著的非編碼RNA;27條變化顯著的miRNA，以

4、及210個可變剪切方式變化顯著的基因?？梢钥闯?，在Huh7細胞系感染HCVcc以后，宿主分子TXNIP的mRNA上調(diào)約3.7倍。采用RT-PCR法，對感染HCVcc和對照組的Huh7細胞中TXNIP的mRNA轉(zhuǎn)錄情況進行驗證，再一次確定了在HCVcc感染的Huh7細胞中TXNIP轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。為進一步研究HCVcc感染后基因表達譜變化，對用MOI=1的HCVcc感染12h，36 h，60 h的Huh7細胞系的基因轉(zhuǎn)錄組進行轉(zhuǎn)錄組深度

5、測序，并將其與各時間點的對照樣品進行對比，結果表明:TXNIP的mRNA在HCVcc感染后36h，60 h均有明顯上調(diào)，以36h上調(diào)最為顯著。
　　（二）干擾TXNIP表達會使HCV復制受到影響
　　合成針對TXNIP的siRNA，轉(zhuǎn)染Huh7或Huh7.5.1細胞以敲低TXNIP的表達。感染MOI=0.2的HCVcc，48 h后免疫熒光檢測HCVcc的感染。結果顯示，TXNIP敲低的細胞與轉(zhuǎn)染非特異結合的siRNA陰性對照

6、組以及未轉(zhuǎn)染siRNA的空白對照組相比，HCVcc的感染量顯著降低。將構建好的TXNIP真核表答載體轉(zhuǎn)染到Huh7和Huh7.5.1細胞中，陰性對照為轉(zhuǎn)染GFP真核表答載體的細胞，空白對照的細胞不進行任何處理。隨后感染MOI=0.2的HCVcc，48 h后免疫熒光檢測HCVcc的感染。結果顯示，TXNIP過表答的細胞與轉(zhuǎn)染GFP表達質(zhì)粒的陰性對照以及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對照細胞相比，HCVcc的感染有所提高。
　　為檢測宿主分子TXN

7、IP對HCV入侵的影響，將siRNA轉(zhuǎn)染至Huh7.5.1細胞系中降低TXNIP表達，陰性對照為轉(zhuǎn)染非特異結合的siRNA，空白對照不做處理，分別感染HCV入侵模型:con1型的HCVpp。培養(yǎng)72 h后直接在熒光顯微鏡下觀察帶有綠色熒光標記的HCVpp感染細胞，并計數(shù)。結果顯示，敲低TXNIP的表達不影響HCVpp的入侵。
　　為檢測宿主分子TXNIP對HCV復制的影響。在1b基因型HCV亞基因組復制子BB7細胞系中轉(zhuǎn)染siRN

8、A干擾TXNIP的表達，對照組轉(zhuǎn)染非特異結合的siRNA。轉(zhuǎn)染72 h后抽提BB7細胞系中RNA，采用RT-PCR檢測J6/JFH1型HCV非結構基因的含量。結果顯示降低宿主分子TXNIP的表達，HCV的復制水平隨之明顯降低。
　　綜上所述，宿主細胞中的TXNIP對HCV的感染有促進作用。這種促進作用可能作用于HCV復制階段。
　?。ㄈ〩CV感染不會誘導Huh7.5.1細胞系中TXNIP上調(diào)
　　為驗證HCVcc感染

9、誘導TXNIP上調(diào)的情況是否在其它可以感染HCV的細胞系中成立，在Huh7和Huh7.5.1中進行了更細致的研究。其中Huh7.5.1和Huh7相比，RIG-1基因發(fā)生突變，因此在病毒RNA誘導的IFN合成方面具有缺陷。用MOI=0.5的HCVcc感染Huh7和Huh7.5.1細胞，分別取感染12h、以及1-4天的樣本以及相應的對照樣本，用RT-PCR檢測TXNIP mRNA的變化情況。結果顯示，在Huh7細胞中，HCVcc感染1天以后

10、即可以檢測到TXNIP在mRNA水平和蛋白水平上的上調(diào)。而在Huh7.5.1細胞中，HCVcc感染并沒有使TXNIP的mRNA和蛋白表達量有所提高。
　?。ㄋ模└蓴_素誘導Huh7和Huh7.5.1細胞系中TXNIP上調(diào)
　　分別合成IFN-α、IFN-β以及IFN-λ的真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞，收取細胞上清以及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)上清（對照）。用不同濃度的干擾素上清處理HCVcc感染的Huh7.5.1細胞，2天后免疫熒光