MiR-330，miR-101，miR-449a及XIST對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、前言:
　　膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma，GBM)是成人最常見并具有致死性的原發(fā)性腦腫瘤。盡管給予積極的手術(shù)治療，及術(shù)后結(jié)合放療和化療，其中位生存時(shí)間仍少于2年。有證據(jù)表明，在GBM組織中存在著一類具有干細(xì)胞特性的亞群細(xì)胞，此亞群細(xì)胞被稱為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioblastoma stem cells，GSCs)，該亞群細(xì)胞具有具有極強(qiáng)的自我更新、多向分化及高致瘤能力，并對(duì)放射治療及化學(xué)藥物治療具有極強(qiáng)的抵抗性。GSCs已

2、被證實(shí)與膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的RNA，已被證實(shí)對(duì)人類基因表達(dá)的調(diào)控起著重要作用。LncRNAs在調(diào)節(jié)干細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)基因的表達(dá)和腫瘤形成過程中起到關(guān)鍵作用。異常表達(dá)的lncRNAs與腫瘤的形成密切相關(guān)，其中就包括膠質(zhì)瘤。關(guān)于lncRNA功能的研究已證實(shí)lncRNAs類似分子海綿可競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNAs的表達(dá)。
　　SH3GL2主要分布于中樞神經(jīng)系

3、統(tǒng)，特別是突觸前神經(jīng)節(jié)，而在其它組織中其表達(dá)水平較低[1，2]。有研究顯示SH3GL2在多種腫瘤組織中低表達(dá)，如非小細(xì)胞肺癌和喉癌[3，4]。Potter等研究發(fā)現(xiàn)在小兒毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤中檢測(cè)到SH3GL2基因缺失，這表明SH3GL2在腦腫瘤組織中可能起腫瘤抑制作用[5]。
　　本論文主要研究miR-330，miR-101，miR-449a及XIST對(duì)GBM細(xì)胞系及GSCs生物學(xué)行為的調(diào)控作用，并初步明確其可能的分子機(jī)制。這些分

4、子機(jī)制的闡明可為神經(jīng)膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新途徑。
　　方法:
　　1、人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87和U251及人胚腎細(xì)胞系HEK293T的培養(yǎng)。
　　2、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離與鑒定。
　　3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的建立: SH3GL2過表達(dá)、SH3GL2表達(dá)沉默和miR-330表達(dá)沉默的穩(wěn)定表達(dá)GSCs。
　　4、MiRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染:miR-330 mimics、miR-330 inhi

5、bitors、miR-101agomir、 miR-101 antagomir、miR-449a agomir、miR-449a antagomir、miR-152agomir、miR-152 antagomir以及它們各自的陰性對(duì)照。
　　5、慢病毒載體的構(gòu)建和感染，建立穩(wěn)定過表達(dá)KLF6、表達(dá)沉默KLF6、過表達(dá)MAZ、表達(dá)沉默MAZ、過表達(dá)miR-101、過表達(dá)miR-449和表達(dá)沉默XIST的GSCs。
　　6、應(yīng)用

6、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-330、miR-101、miR-449a和XIST的表達(dá)水平，以及KLF6和MAZ的mRNA表達(dá)水平。
　　7、應(yīng)用EdU摻入法檢測(cè)GSCs的增殖作用。
　　8、應(yīng)用CCK8法檢測(cè)U87、U251和GSCs增殖能力的變化。
　　9、應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)U87、U251和GSCs凋亡的變化。
　　10、應(yīng)用Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U87、U251和GSCs遷移和侵襲能力的變化

7、。
　　11、應(yīng)用Western blot法檢測(cè)U87、U251和GSCs中SH3GL2、KLF6、MAZ、CHI3L1和PDPN的蛋白表達(dá)變化。
　　12、應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析miR-101對(duì)KLF63'-UTR區(qū)的靶向調(diào)節(jié);miR-449a對(duì)MAZ3'-UTR區(qū)的靶向調(diào)節(jié);miR-152對(duì)XIST的靶向調(diào)節(jié);KLF6對(duì)CHI3L1和MAZ對(duì)PDPN的啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)。
　　結(jié)果:
　　1、成功分離鑒定

8、了細(xì)胞系來源及組織來源的GSCs。
　　2、MiR-330在GSCs-U87和GSCs-U251中高表達(dá)，而SH3GL2在GSCs-U87和GSCs-U251中低表達(dá)。過表達(dá)miR-330通過抑制SH3GL2的表達(dá)激活ERK和PI3K/AKT通路活性，上調(diào)XIAP和Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Caspase-3和TRAIL的表達(dá)，促進(jìn)GSCs-U87和GSCs-U251的增殖，遷移和侵襲能力，并抑制細(xì)胞凋亡。
　　3、沉默mi

9、R-330聯(lián)合過表達(dá)SH3GL2可對(duì)GSCs-U87和GSCs-U251的在體生長(zhǎng)產(chǎn)生最強(qiáng)的抑制作用。
　　4、MiR-101在膠質(zhì)瘤組織和GSCs中低表達(dá)，而KLF6在膠質(zhì)瘤組織和GSCs高表達(dá)。過表達(dá)miR-101通過抑制KLF6表達(dá)，進(jìn)而降低CHI3L1的表達(dá)，減弱MEK1/2和PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)通路的活性，抑制GSCs的增殖，遷移和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　5、過表達(dá)miR-101聯(lián)合沉默KLF6可對(duì)GS

10、Cs的在體生長(zhǎng)產(chǎn)生最強(qiáng)的抑制作用。
　　6、MiR-449a在膠質(zhì)瘤組織、U87、U251和GSCs中低表達(dá)，而MAZ在膠質(zhì)瘤組織、U87、U251和GSCs中高表達(dá)，過表達(dá)miR-449a通過抑制MAZ表達(dá)，進(jìn)而降低PDPN的表達(dá)，降低PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)通路的活性，下調(diào)XIAP、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Caspase-3和TRAIL的表達(dá)，抑制U87、U251和GSCs的增殖，遷移和侵襲能力，并促

11、進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　7、過表達(dá)miR-449a聯(lián)合沉默MAZ可對(duì)GSCs的在體生長(zhǎng)產(chǎn)生最強(qiáng)的抑制作用。
　　結(jié)果
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)，miR-330，miR-101，miR-449a及XIST在GSCs中表達(dá)，通過建立穩(wěn)定表達(dá)的GSCs，進(jìn)一步分析檢測(cè)了miR-330，miR-101，miR-449a及XIST在GSCs中的表達(dá)情況及其功能。通過改變上述基因的表達(dá)水平，檢測(cè)到它們的表達(dá)改變可以影響GSCs的生物學(xué)行為。進(jìn)

12、一步明確了其調(diào)節(jié)GSCs生物學(xué)行為的潛在分子機(jī)制。此外，裸鼠移植瘤及生存期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-330，miR-101，miR-449a及XIST在體內(nèi)對(duì)GSCs的影響及作用。
　　綜上所述，本研究首次揭示了miR-330，miR-101，miR-449a及XIST對(duì)GSCs生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用。MiR-330通過抑制SH3GL2表達(dá)，激活ERK和PI3K/AKT通路活性，上調(diào)XIAP和Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Caspase-3和T

13、RAIL的表達(dá)，促進(jìn)GSCs的增殖，遷移和侵襲能力，并抑制細(xì)胞凋亡。MiR-101通過抑制KLF6表達(dá)，進(jìn)而降低CHI3L1的表達(dá)，減弱MEK1/2和PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)通路的活性，抑制GSCs的增殖，遷移和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MiR-449a通過抑制MAZ的表達(dá)，進(jìn)而降低PDPN的表達(dá)，減弱PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)通路的活性，下調(diào)XIAP、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Caspase-3和TRAIL的表達(dá)

14、，抑制U87，U251和GSCs的增殖，遷移和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。XIST與miR-152間存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，沉默XIST通過上調(diào)miR-152的表達(dá)抑制GSCs的增殖，遷移和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，本研究結(jié)果為腦膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新靶點(diǎn)。
　　結(jié)論:
　　1、MiR-330在GSCs中高表達(dá)，SH3GL2在GSCs中低表達(dá)。
　　2、沉默miR-330通過上調(diào)SH3GL2的表達(dá)，抑制

15、ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路活性，抑制GSCs的增殖、遷移和侵襲能力，并促進(jìn)GSCs凋亡。與沉默miR-330或過表達(dá)SH3GL2相比，沉默miR-330同時(shí)過表達(dá)SH3GL2對(duì)GSCs的增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用更強(qiáng)。
　　3、MiR-101在膠質(zhì)瘤組織和GSCs中低表達(dá)，KLF6在膠質(zhì)瘤組織和GSCs中高表達(dá)。
　　4、過表達(dá)miR-101通過下調(diào)KLF6的表達(dá)抑制GSCs的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋

16、亡。
　　5、在GSCs中過表達(dá)miR-101，通過靶向結(jié)合KLF6并下調(diào)其表達(dá)，KLF6通過與CHI3L1的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并下調(diào)CHI3L1啟動(dòng)子活性，抑制CHI3L1的表達(dá);以及抑制MEK1/2和PI3K/AKT通路的活性;從而抑制GSCs的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)GSCs凋亡。與過表達(dá)miR-101或沉默KLF6相比，過表達(dá)miR-101同時(shí)沉默KLF6對(duì)GSCs的增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用更強(qiáng)。
　　6、MiR-4

17、49a在GSCs中低表達(dá)，MAZ在GSCs中高表達(dá)。
　　7、在GSCs中過表達(dá)miR-449a，通過靶向結(jié)合MAZ并下調(diào)其表達(dá)，MAZ通過與PDPN的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并下調(diào)PDPN啟動(dòng)子活性，抑制PDPN的表達(dá);以及抑制PI3K/AKT通路的活性;降低XIAP、 Bcl-2以及MMP2、MMP9的表達(dá);增加Capase-3和TRAIL的表達(dá);從而抑制GSCs的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)GSCs凋亡。
　　8、與過表達(dá)miR-44